microRNA-873在子宫内膜癌中的表达及对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响

黄锦，刘佳淑，刘胜凤，敬巧，刘玉娟

(川北医学院附属医院妇产科，四川南充 637000)

子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖道中常见的恶性肿瘤之一。早期患者的5年生存率超过90%，而晚期以侵袭性转移的发生和高复发率为特征，因此晚期子宫内膜癌患者的5年生存率降至20%以下[1-2]。近年来研究表明，微小RNA(microRNA)与肿瘤发生关系密切，可参与肿瘤的发生及发展过程中，故而有望成为肿瘤诊断和治疗的新型标志物[3]。miR-873作为一类微小RNA，在食管癌和肝癌中均有不同程度的异常表达[4-5]，但其在子宫内膜癌中作用机制的研究报道少见。因此，本研究旨在探讨miR-873在子宫内膜癌组织中的表达及对人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和侵袭的影响，从而为子宫内膜癌的诊断和治疗提供新的靶点。

1 材料

1.1标本来源 收集2016年1月至2020年1月于川北医学院附属医院就诊的88例子宫内膜癌患者手术切除的子宫内膜癌组织，患者年龄(49.7±10.0)岁。纳入标准[6]：经病理检查证实为子宫内膜癌；术前未接受化疗及放疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者。临床资料中肌层浸润深度：≥1/2肌层22例，<1/2肌层66例；伴淋巴结转移18例，其中累及淋巴管15例；国际妇产科联盟(FIGO)分期：Ⅰ～Ⅱ期66例，Ⅲ～Ⅳ期22例；组织学类型：Ⅰ型78例，Ⅱ型10例；分化程度：低分化34例，中高分化54例。另收集同期因子宫肌瘤行子宫切除术的60例患者正常子宫内膜组织作为对照组，患者年龄(50.6±9.8)岁。两组年龄差异无统计学意义(t=0.566，P>0.05)，具有可比性。本研究经川北医学院附属医院医学伦理学委员会批准(No.2015ER117-1)，患者及家属知情同意。

1.2细胞系、主要试剂及仪器 人子宫内膜癌细胞系Ishikawa(武汉博士德公司)。DMEM、胎牛血清、DMSO、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，miRNA提取试剂盒、miRNA荧光定量PCR检测试剂盒、miRNA cDNA合成试剂盒(大连宝生物公司)，MTT试剂(上海东仁化学科技公司)，结晶紫(美国Sigma公司)，Matrigel(美国BD公司)，细胞转染试剂Lipofectamine 2000(美国Epitomics公司)，miR-873模拟物(miR-873 mimic)及模拟物阴性对照(miR negative control，miR-NC,广州市锐博公司)。Transwell小室(美国Millipore公司)，ACB-4A1超净工作台(新加坡Esco公司)，3110型CO2培养箱(美国Thermo公司)，QuantStudioTM12K Flex实时荧光定量PCR(美国Life technologies公司)，SpectraMax M5酶联仪(美国Molecular device公司)，IX71正置/倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.3方法

1.3.1细胞分组与转染 将Ishikawa细胞加入至含10%胎牛血清的DMEM中，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。于转染前1 d接种于6孔细胞培养板，待细胞融合度达30%～50%时，利用Lipofectamine 2000将miR-873 mimic和阴性对照(miR-NC)瞬时转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞，并分为空白对照组、阴性对照组和miR-873过表达组。其中,空白对照组：细胞不做处理，正常培养;阴性对照组：按照Lipofectamine 2000说明书将miR-NC转染至Ishikawa细胞，转染终浓度为50 nmol/L，每孔转染2 mL；miR-873过表达组：按照Lipofectamine 2000说明书将miR-873 mimic转染至Ishikawa细胞，转染终浓度为50 nmol/L，每孔转染2 mL。转染6 h后更换为含10%胎牛血清培养基继续培养24 h并进行后续实验。

1.3.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 取大小约为0.5 cm×1.0 cm的子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织，于液氮中进行充分研磨，另取各组转染后细胞约1×106个，采用miRNA提取试剂盒提取组织及细胞中miRNA，使用SpectraMax M5酶联仪检测吸光度(A260/280 nm)值为1.8～2.1的样本用于后续实验。取2 μL miRNA，按照miRNA cDNA合成试剂盒说明书操作获得cDNA，置于-20 ℃保存。根据NCBI中GenBank提供的miR-873(序列号：NC_000009.12)，U6(序列号：NC_000898.1)基因序列，由上海生工公司设计并合成引物。采用miRNA荧光定量PCR检测试剂盒检测组织及细胞中miR-873的表达水平，引物序列见表1。PCR反应体系共20 μL，包括：5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 12 μL。循环参数：95 ℃预变性15 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；在60 ℃时采集荧光信号，并用QuantStudioTM12K Flex实时荧光定量PCR自带软件进行熔解曲线分析，以U6作为内参照，采用2-△△Ct法计算miR-873的表达水平。

表1 引物序列

1.3.3MTT法检测细胞的增殖能力 采用12.5 g/L胰蛋白酶将各组细胞消化并接种于96孔细胞培养板中(按3 000个/孔的细胞密度接种)，每孔培养液总体积为100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待其贴壁，更换为新的DMEM培养基，每孔加入混有10% MTT检测试剂的培养液，37 ℃温育1 h，从培养箱取出96孔细胞培养板室温平衡后分别于24 h、48 h、72 h和96 h时，采用SpectraMax M5酶联仪在波长490 nm处检测各孔吸光度(A490 nm)值，计算平均值，实验重复3次。

1.3.4Transwell试验检测细胞的侵袭能力 取各组转染后的Ishikawa细胞，用不含血清的DMEM培养基重悬，调节细胞密度为1×106/mL，接种于Transwell小室的上室中，在小室下室加入300 μL含胎牛血清的DMEM，37 ℃温育24 h。用无菌棉签轻轻擦拭上室中的上层细胞，擦拭干净后用0.2%结晶紫染色10 min，弃去染液，PBS清洗5 min，置于光学显微镜下观察并拍照，计数穿膜细胞数，实验重复3次。

2 结果

2.1子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中miR-873的表达水平 与正常子宫内膜组织(1.07±0.04)比较，子宫内膜癌组织中miR-873的表达水平(0.52±0.12)明显降低，差异具有统计学意义(t=34.199，P<0.05)。

2.2miR-873表达与子宫内膜癌患者临床病理参数的关系 子宫内膜癌患者癌组织中miR-873的表达水平与肌层浸润深度、淋巴结转移和FIGO分期有关(t分别为11.557、9.626、7.923，P均<0.05)；而与年龄、分化程度、组织类型无关(t分别为0.407、0.381、0.536，P均>0.05)，见表2。

表2 miR-873表达与子宫内膜癌患者临床病理参数的关系

2.3qRT-PCR检测各组细胞miR-873的表达水平 与空白对照组(0.51±0.02)和阴性对照组(0.51±0.01)比较，miR-873过表达组中miR-873的表达水平(1.38±0.02)明显升高，差异具有统计学意义(F=5 855.962，P<0.05)，提示转染成功；进一步行组间两两比较结果显示，miR-873过表达组miR-873的表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组，差异具有统计学意义(t分别为93.985、93.448，P均<0.05)，而阴性对照组和空白对照组之间比较差异无统计学意义(t=0.537，P>0.05)。

2.4MTT法检测各组Ishikawa细胞的增殖能力 与空白对照组和阴性对照组比较，转染24 h后miR-873过表达组细胞增殖受到抑制，差异具有统计学意义(P均<0.05)；进一步行组间两两比较结果显示，miR-873过表达组在24 h、48 h、72 h和96 h时的细胞增殖水平显著低于空白对照组(t分别为5.908、15.995、19.913、30.242，P均<0.05)和阴性对照组(t分别为5.514、14.715、19.048、28.542，P均<0.05)，差异具有统计学意义；而阴性对照组和空白对照组各时间点之间比较差异无统计学意义(t分别为0.394、1.280、0.866、1.699，P均>0.05)。见图1。

注：与空白对照组比，*，P<0.05；与阴性对照组比，#，P<0.05。

2.5Transwell试验检测各组细胞的侵袭能力 各组细胞于转染24 h后行Transwell试验，结果表明，与阴性对照组和空白对照组比较，miR-873过表达组细胞穿膜数显著降低，差异具有统计学意义(F=36.553，P<0.05)；进一步行组间两两比较结果显示，miR-873过表达组细胞穿膜数显著低于空白对照组和阴性对照组，差异具有统计学意义(t分别为7.571、7.227，P均<0.05)，而阴性对照组和空白对照组之间比较差异无统计学意义(t=0.344，P>0.05)。见图2。

注：A，阴性对照组；B，空白对照组；C，miR-873过表达组。

3 讨论

研究表明，结肠癌[7]、肝细胞癌[8]、非小细胞肺癌[9]等恶性肿瘤中miR-873的表达均降低，提示其在肿瘤发生和发展中起着至关重要的作用。Lin等[10]研究发现，miR-873在原发性胃癌组织中下调，在胃癌进展过程中起到肿瘤抑制作用。本研究结果表明，子宫内膜癌组织中miR-873的表达水平与正常子宫内膜组织相比显著降低，提示miR-873可能在子宫内膜癌进展过程中发挥抑癌基因的功能。进一步对miR-873的表达水平与子宫内膜癌患者临床病理参数进行分析，结果发现miR-873低表达与肌层浸润深度、淋巴结转移和国际妇产联合会FIGO分期有关。肌层浸润深度≥1/2肌层、伴淋巴结转移以及FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期的子宫内膜癌患者组织中miR-873的表达水平显著低于肌层浸润深度<1/2肌层、无淋巴结转移以及Ⅰ～Ⅱ期的子宫内膜癌患者组织，提示miR-873低表达可能促进子宫内膜癌患者病情的进展。

miRNA广泛存在于真核生物中，在细胞分化、细胞周期、迁移等生理和病理过程中发挥着关键作用[11]。Wang等[12]研究发现，miR-873-5p在甲状腺癌组织和细胞系中表达下调，过表达miR-873-5p可抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Liang等[13]研究表明，miR-873在宫颈癌组织中呈低表达；miR-873的上调明显抑制了人宫颈癌C33a细胞的增殖、侵袭和迁移，但在SiHa细胞中下调的miR-873呈现相反的结果。为探讨miR-873对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭的影响，本研究采用Lipofectamine 2000将miR-873 mimc瞬时转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞，结果显示miR-873过表达组miR-873表达水平明显增加，提示转染成功。笔者进一步通过增殖与侵袭试验检测Ishikawa细胞增殖和侵袭能力，结果显示miR-873过表达组细胞增殖和侵袭能力明显减弱，提示过表达miR-873能明显抑制Ishikawa细胞增殖和侵袭能力。

综上所述，miR-873在人子宫内膜癌组织中呈低表达，通过上调miR-873表达可抑制Ishikawa细胞增殖和侵袭的能力，初步明确miR-873在子宫内膜癌中发挥抑癌基因的作用。但本研究仍存在以下不足之处：(1)本研究中的临床样本较少，且未进行预后分析；(2)本研究只是初步明确miR-873在子宫内膜癌中发挥抑癌基因的作用，没有进行靶基因的预测及相关机制研究；(3)本次实验只是在体外细胞实验中进行验证，没有进行体内动物实验，后续应进行体内动物实验进行验证，进一步完善miR-873对子宫内膜癌发生、发展的作用机制。