肠外营养混合液中维生素C 含量测定的研究

穆殿平，解晓帅，张凤莹，许煜静，杨金荣*

（1.天津市第一中心医院，天津 300192；2.天津医科大学药学院，天津 300070）

维生素C（vitamin C，Vc）参与体内多种代谢过程，可增加肌体抵抗能力，促进胶原合成，具有抗病毒及抗癌作用［1，2］。近年来研究表明，Vc 在对抗脓毒血症发挥一定疗效［3］。根据临床需要，Vc 常加入肠外营养混合液（TNA）中，为不能耐受肠内营养或消化道受损患者提供肠外营养治疗［4］。有报道，肠外营养添加大剂量Vc对急性重症创伤患者较好的治疗效果［5］。然而，由于TNA 处方组分多，不同物质混合可能使其物理及化学性质发生变化，有可能降低TNA 混合液的安全性及稳定性［6，7］，尤其是Vc 含有烯二醇结构易被氧化变色，甚至失效［8］。因此，测定TNA 中Vc 的含量变化是非常可靠的考查其有效性的指标，文献中关于Vc 含量测定方法报道较多，但多为单一组分或简单配伍条件，且重复性较差。本研究旨在建立操作简便、适用性广、重现性好、结果准确的高效液相色谱法（HPLC），用于测定TNA混合液中Vc 注射液含量，确保临床TNA 治疗的安全性和有效性。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；十万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器）；Photoelectron TECHNOLOGY 色谱柱恒温箱；AP-9901S 真空泵（天津兰博实验仪器）。

1.2 试剂 维生素C 对照品（中国食品药品检定研究院，批号100425-201504；规格：100 mg/支；纯度：100.0%）；维生素C 注射液（天津金耀药业有限公司，批号1809301；规格：0.5 g/5 ml）；甲醇和乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）；其他试剂均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Zirchrom Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：0.34%（w/v）磷酸二氢钾-氢氧化四丁基铵-乙腈（92.5∶2.5∶5，v/v/v，pH 3.0）；流速：0.8 ml/min；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品储备液的制备 精密称取0.500 g 维生素C 对照品，用流动相溶解并定容至100 ml，得浓度5 mg/ml 的Vc 对照品储备液，摇匀，冷藏、避光保存。

2.2.2 TNA 处方设计 根据普通成人及住院患者对Vc 的日需求量设计实验中TNA 处方。处方中具体各成分配比见表1。处方0（0 组）为阴性对照组不添加Vc 注射液，其余三组Vc 的含量分别为0.735、1.46 和2.88 mg/ml。四组供试溶液均在局部百级的水平层流台由专业人员按照《静脉用药集中调配质量管理规范》中相关操作规程规范配制，灌装在1 L 营养袋中，室温、避光的条件下放置待测。

2.3 系统适用性及专属性试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液15 ml，置100 ml 量瓶中，加入流动相最终配制成含Vc 对照品0.75 mg/ml 的对照品溶液。取处方0（阴性对照组）溶液50 ml，置100 ml 量瓶中，加入对照品储备液15 ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为样品对照溶液；取处方1 溶液50 ml，置100 ml 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；取处方0 溶液50 ml，置100 ml 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为阴性对照液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，HPLC 色谱图见图1。维生素C 色谱峰保留时间为5.5 min，与相邻峰分离度良好。维生素C 色谱峰位置处无相关干扰，结果表明专属性良好。

图1 对照品（A）样品对照（B）处方1 供试品（C）阴性对照（D）HPLC 色谱图

2.4 标准曲线的制备 分别精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 和12.0 ml 至100 ml 的棕色量瓶中，加入流动相溶液稀释至刻度，避光。按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，以各个浓度的维生素C 对照品峰面积（Y）对相应的浓度（X）进行线性回归，得到标准曲线方程式为：Y=27 105X-10 325（r=0.999 8），维生素C 在50～600 μg/ml 浓度范围内呈线性关系。

2.5 精密度试验 精密量取处方1 溶液50 ml，置100 ml 棕色量瓶中，用流动相稀释至刻度，充分混匀，避光，作为供试品溶液。精密量取上述供试品溶液20 μl，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6 次，记录峰面积，结果RSD 为0.96%。

2.6 重复性试验 精密量取处方1 溶液50 ml，置100 ml棕色量瓶中，用流动相稀释至刻度，充分混匀，避光，作为供试品溶液。同法配制6 份，各取上述供试品溶液20 μl 进样，按照“2.1”项下色谱条件进行含量测定，计算含量RSD 来考查试验的重复性，结果RSD 为1.78%。

2.7 回收率试验 取处方0 溶液，精密量取9 份，每份50 ml，置100 ml 棕色量瓶中，分别精密加入5 mg/ml 的维生素C 对照品储备液5.0（低浓度）、7.5（中浓度）和10.0 m（l高浓度）3 个浓度，流动相稀释至刻度，每个浓度配制3 份，峰面积取平均值计算回收率。按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率和RSD，结果平均回收率为99.23%，RSD 为1.06%。见表2。

表2 回收率试验结果（n=9）

2.8 样品溶液的含量测定 根据方法学中考查的Vc浓度的线性范围，处方1、处方2 和处方3 分别精密吸取50.0、25.0 和12.5 ml，置100 ml 的量瓶中，用流动相稀释至刻度，充分混匀，避光备用。按照“2.1”项下色谱条件进行含量测定。结果处方1、处方2 和处方3 平均含量分别为0.74、1.46 和2.88 mg/ml，见表3。

表3 不同处方Vc 样品溶液含量测定结果（n=3）

2.9 TNA 溶液的稳定性 处方1、处方2、处方3 分别在0、4、8、12 和24 h 时取样，按照“2.1”项下色谱条件分别对处方1、处方2、处方3 溶液进行测定，记录峰面积，以每组0 h 时Vc 浓度对应的峰面积为100%，计算每组其他时间点Vc 的相对百分含量。结果见表4。

表4 含不同浓度维生素C的TNA 溶液随放置时间的相对含量

3 讨论

3.1 方法学讨论

3.1.1 检测波长的确定 用紫外分光光度计在200 ～800 nm 对维生素C 进行扫描，在波长210 nm 处有最大吸收，故测定波长选择210 nm。

3.1.2 流动相的选择 本试验中样品液为多种组分的TNA 混合液，并且多种物质均有紫外吸收峰，极性与维生素C 相似，很可能干扰维生素C 的含量测定。在早期预试验中，探索正确的流动相时多以参考文献［9］为主，结果不是出峰时间过早导致无法准确测定TNA 中维生素C 含量，就是无法很好分离多组分营养液中的维生素C 峰。经过探索，发现以0.025 mol/L 磷酸二氢钾与0.010 mol/L 四丁基氢氧化铵加入5%的乙腈作为流动相，维生素C 的保留时间在5 min 左右，并可以将相似极性的多种物质与维生素C 的吸收峰分开，峰形良好，不拖尾，分离的大于1.5。

3.1.3 流动相pH 值的确定 由于维生素C 不稳定，具有较强的还原性，易氧化，故其注射剂均添加一定量的抗氧剂来确保其稳定性。根据其在酸性介质中氧化的速度减慢或生成单钠盐而不致发生水解［10］，确定流动相应呈偏酸性。当流动相pH 值调为2.0 时，维生素C主峰拖尾严重，而尝试流动相pH 值调节至3.5 时，出现峰形重叠的情况，经过反复探索，调节流动相pH 值为3 时能很好分开极性相似的几个峰，并确保了维生素C 水溶液的稳定。有文献报道［11］，当pH 值大于5 时，会导致维生素C 的降解加速，并随着pH 值越来越高，维生素C 降解反应越快。因此，流动相pH 值确定为3.0。

3.2 样品液含量测定 试验数据（表4）显示，各组TNA中Vc 含量随放置时间的延长逐渐下降。1 组和2组分别在放置4 和8 h 后相对含量已经减少到90%以下，根据《中国药典》2015 版规定，即为失去疗效。3组在放置12 h 时，含量仅下降了5.9%；提示TNA 中加入浓度越高的Vc 注射液，其含量下降越慢，可能与Vc 注射液中抗氧剂浓度有关；同时也为进一步研究TNA 中是否可以加入适宜浓度的Vc 注射液奠定了基础。

3.3 其他影响因素 由于维生素C 具有光敏感性，遇空气中的氧气易氧化分解［11］，故本试验全程保持避光条件，将配好的样品液及试剂密闭保存，避免与外界的空气长时间的接触。由于样品液为多种注射剂调配而得，而各种注射剂都有相应规格的装量差异，会导致配制的TNA 实际体积与理论体积有所差异。因此在本试验中，样品溶液不同时间的维生素C 含量均以0 h 时测定浓度做比值，计算相对含量，从而排除偶然误差。

4 结论

本文建立了测定肠外营养混合液中Vc 含量的高效液相色谱法，该方法操作简单，快速准确，且分离度和重复性均较好，可用于考查TNA 中Vc 注射液的含量变化。近些年，关于TNA 中加入Vc 注射液稳定性和安全性国内外研究报道较少，该方法的建立可以说为进一步深入研究Vc 注射液加入TNA 中不同浓度，不同配伍的含量变化奠定了基础，同时也为临床肠外营养应用更加安全、有效提供了很好的药学研究路径。