基于网络药理学的丹参活性成分治疗阿尔茨海默病的作用机制研究Δ

李惟滔，赵明明，陶玉瑛，王鸣璐，肇丽梅

(中国医科大学附属盛京医院药学部，辽宁 沈阳 110004)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是临床最常见的退行性神经系统疾病，由诸多因素导致，不宜针对单一靶点采用药物治疗[1]。近年来，以多成分、多靶点起效的中药在难治病中的应用研究颇受关注。丹参是中医临床常用的中药材，具有抗氧化、调节内分泌和保护心血管的药理活性，可用于心脑血管疾病和高脂血症等的治疗[2-4]。丹参含有多种活性成分，可以通过相同和(或)不同作用机制发挥抗AD作用。为给丹参在AD治疗中的应用研究提供理论基础，有必要系统、全面地阐明其发挥抗AD作用的主要活性成分及其作用机制。网络药理学可从生物网络调控角度，研究中药材及其复方制剂的作用机制，并理解中药方剂复杂化学体系与机体复杂生物系统的相互作用关系[5]。本研究借助网络药理学平台及相关分析软件，结合基因本体(gene ontology，GO)功能分析和基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的信号通路分析，挖掘丹参抗AD的相关活性成分及作用靶点，从系统生物学的角度探讨丹参抗AD的潜在生物学机制。

1 资料与方法

1.1 建立药物活性成分数据库

中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)致力于发现中医药常用药物、靶标和疾病之间的关系[6]。TCMSP数据库收录了中药材及其主要活性成分的药动学特性，包括口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、类药性(drug likability，DL)、血-脑脊液屏障透过性(blood-brain barrier，BBB)及水溶性等。本研究通过检索TCMSP数据库(检索时间为从建库至2019年12月)，获得丹参活性成分信息，从而构建丹参活性成分数据库。检索词为“丹参”或“Danshen”，设定丹参活性成分的筛选条件为“OB≥30%、DL≥0.18和BBB≥-0.30”。

1.2 建立作用靶点数据库

1.2.1 建立丹参活性成分的作用靶点数据库：UniProt数据库(http://www.uniprot.org)是信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库，包含了大量蛋白质的生物功能信息[7]。基于上述构建的丹参活性成分数据库，在TCMSP数据库中检索各成分的作用靶标，将获得的靶标导入UniProt数据库，从而获得所有靶点的基因名，并用于构建药物作用靶点数据库和进行后续分析。

1.2.2 建立AD的疾病靶点数据库：检索人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)(https://omim.org/)、美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)等，检索时间截止至2019年12月，设定物种类别为“Homo sapiens”，检索词为“Alzheimer’s disease”，导出检索结果并剔除重复值，建立AD的疾病靶点数据库。

1.3 获取丹参活性成分的药效靶点

利用R软件(版本号3.6.1)，通过调用Venn程序包，对上述整理的丹参活性成分作用靶点数据和疾病靶点数据绘制韦恩图，从而获得丹参活性成分的药效靶点。

1.4 蛋白质相互作用关系分析

采用String 11.0数据库和GeneMANIA数据库，构建并分析药效蛋白质-蛋白质相互作用网络。String数据库(https://string-db.org/)和GeneMANIA数据库覆盖扩大的蛋白质-蛋白质关联网络，支持发现和阐明全基因组数据集的生物学功能，可用于识别靶点基因的相互作用关系[8-9]。本研究将丹参活性成分药效靶点以基因名形式分别导入String 11.0数据库和GeneMANIA数据库，设定物种类别为“Homo sapiens”，然后进行蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建与分析。

1.5 GO和KEGG信号通路富集分析

DAVID生物信息资源数据库(https://david.ncifcrf.gov)由生物知识库和系列分析工具组成，旨在系统地从大型基因或蛋白质列表中提取具有生物学意义的信息[10-11]。本研究将筛选出的药效靶点转换为基因名，上传至DAVID数据库，进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析，考察丹参活性成分的AD相关药效靶点的功能分布及其可能涉及到的信号调控通路。

1.6 网络关系图的构建及拓扑分析

利用Cytoscape 3.7.2可视化作图软件，分别构建“药物-疾病-靶点”网络关系图和“药物-靶点-信号通路”网络关系图。网络图的节点分别表示药物、活性成分、作用靶点和信号通路，节点之间的连线表示活性成分与靶点的相互作用关系。使用Cytoscape 3.7.2软件中的NetworkAnalyzer计算节点度值(Degree)，进而评价活性成分和靶点的重要性。

2 结果

2.1 丹参活性成分数据库

通过检索TCMSP数据库，获得202个丹参活性成分。根据设定的筛选条件“OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3”筛选丹参活性成分，最后将45个丹参活性成分导出，用于构建药物活性成分数据库，包括紫丹参萜醚A、甲酰丹参酮、丹参酚醌Ⅱ和丹参酮ⅡA等。OB排序居前15位的丹参活性成分见表1。

表1 OB排序居前15位的丹参活性成分Tab 1 Top 15 active components of Danshen ranked by OB

2.2 丹参活性成分作用靶点和疾病靶点数据库

从TCMSP数据库导出45个丹参活性成分的靶点信息，剔除重复数据后，共获得43个作用靶标，用于建立活性成分靶点数据库。根据设定的检索策略，检索OMIM、NCBI和GeneCards数据库，导出所有检索到的AD的疾病靶点信息，剔除重复数据后，共获得8 567个疾病靶点，用于构建疾病靶点数据库。采用R 3.6.1软件的Venn程序包对活性成分靶点数据库和疾病靶点数据库取交集并绘制韦恩图，共获得39个交集靶点，涉及到43个丹参活性成分，将其用于后续分析。

2.3 蛋白质-蛋白质相互作用关系分析

将筛选出的丹参活性成分的药效靶点导入String数据库和GeneMANIA数据库进行分析，得到蛋白质-蛋白质相互作用网络图，见图1。分析结果显示，这些蛋白质之间的相互作用主要表现形式为物理性相关、蛋白质共表达、共通路和共定位；其中，物理性相关占25.44%，共表达占46.22%，共通路占9.90%，共定位占18.43%。

图1 活性成分作用靶点的蛋白质相互作用网络图Fig 1 Network diagram of protein interaction of active ingredients targets

2.4 GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析

2.4.1 GO功能富集分析结果：将丹参活性成分的39个药效靶点的基因名上传至DAVID数据库，进行GO功能富集分析。

结果显示，39个药效靶点主要涉及神经递质受体活性、核受体活性、乙酰胆碱受体活性、激素结合和神经递质结合等分子功能。将分析结果按照P值和富集的靶点数量从小到大排序，表2展示了前10位P值较小的丹参活性成分药效靶点的GO分析结果。这些靶点与信号传导、受体活性和蛋白表达等分子生理功能的相关性较强，丹参的活性成分可通过作用靶点调节一系列与AD发病机制相关的分子功能和生理学机制，如通过增强乙酰胆碱受体的活性，帮助改善AD患者的记忆或认知功能等。

表2 活性成分药效靶点的GO分析结果(前10位，以P值从小到大排序 )Tab 2 Results of GO analysis of drug targets of active ingredients(Top 10， sorted by P value from small to large)

2.4.2 KEGG信号通路富集分析结果：将丹参活性成分的药效靶点上传至KEGG数据库，分析丹参发挥抗AD效作用可能涉及到的信号通路。对39个丹参活性成分的药效靶点进行KEGG信号通路富集分析，共获得63条KEGG信号通路，P均<0.005。将分析结果按照P值和富集的靶点数量从小到大排序，表3展示了排序居前10位的丹参活性成分药效靶点的KEGG分析结果。P值较小且富集基因数量较多的信号通路有：神经活动配体-受体相互作用通路(hsa04080)、胆碱能突触通路(hsa04725)、白细胞介素17信号通路(hsa04657)、细胞凋亡(hsa04210)、PI3K/Akt信号通路(hsa04151)和cAMP信号通路(hsa04024)等。KEGG信号通路富集分析结果表明，丹参的活性成分可通过多种途径、多重作用机制发挥抗AD作用。

表3 药效靶点KEGG信号通路分析结果(前10位，以P值从小到大排序)Tab 3 Analysis of KEGG signaling pathway analysis of drug targets(Top 10，sorted by P value from small to large)

2.5 网络关系构建与分析

2.5.1 “活性成分-药效靶点”网络关系构建与分析：利用Cytoscape 3.7.2软件构建丹参“活性成分-药效靶点”相互作用网络，见图2。“活性成分-药效靶点”网络关系图由84个节点和345条连线构成，节点表示活性成分种类和作用靶点类型，连线表示活性成分与靶点之间的相互作用关系。根据节点的Degree大小排序，Degree排序居前5位的丹参活性成分(图2中的菱形节点)为丹参酮ⅡA、4-亚甲丹参新酮、隐丹参酮、异隐丹参酮和鼠尾草酚酮，其Degree分别为21、13、13、13和13；Degree排序居前10位的作用靶点(图2中的方形节点)为毒蕈碱型胆碱受体M1(CHRM1)、毒蕈碱型胆碱受体M3(CHRM3)、肾上腺素能A1A受体(ADRA1A)、前列腺素氧化环化酶1(PTGS1)、毒蕈碱型胆碱受体M5(CHRM5)和乙酰胆碱酯酶(ACHE)、毒蕈碱型胆碱受体M2(CHRM2)、雌激素受体1(ESR1)、毒蕈碱型胆碱受体M4(CHRM4)及雄激素受体(AR)，见表4。

图2 “活性成分-药效靶点”网络关系Fig 2 Network relationship of “active ingredients-drug targets”

表4 Degree排序居前10位的丹参抗AD作用靶点Tab 4 Top 10 anti-Alzheimer’s disease targets of Danshen ranked by Degree

2.5.2 “活性成分-药效靶点-信号通路”网络关系构建与分析：利用Cytoscape 3.7.2软件构建丹参“活性成分-药效靶点-信号通路”网络关系图。43个活性成分、39个作用靶点和63条信号通路的网络关系图见图3。图中，三角形节点表示药效靶点，倒三角形节点表示信号通路，矩形节点表示丹参活性成分；节点之间的连线表示相互作用关系。丹参的多个活性成分可通过相同或不同作用靶点，调控1条或多条与AD相关的信号通路。丹参酮ⅡA、隐丹参酮等可通过作用于相同靶点如CHRM1、CHRM2及CHRM3等调控胆碱能突出通路(hsa04725)；此外，丹参酮ⅡA还可作用于ADR1A调控AMPK信号通路(hsa04152)和钙通道信号通路(hsa04020)；隐丹参酮还可通过作用于淀粉样蛋白前体蛋白(APP)调控血清素能信号通路(hsa04726)。

图3 “活性成分-药效靶点-信号通路”网络关系Fig 3 Network relationship of active ingredient-target-pathway

3 讨论

AD是一种复杂的神经系统退行性疾病，其具体发病机制尚不完全清晰，目前存在多种发病假说，如胆碱能学说、β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)毒性假说、Tau蛋白学说、胰岛素假说和神经血管学说等[12]。临床常联合应用单靶点药物治疗AD，但该治疗方法只能部分缓解AD引起的一些临床症状，且存在一系列不良反应，目前尚无药物可有效地预防、延缓或阻断AD的发病和(或)进展[13]。多组分药物通过多靶点-多通路的协同调控发挥增效作用的同时，还可以作用于其他靶点，减少不良反应的发生，或有助于AD的治疗。

丹参的多种活性成分可通过相同或不同的作用靶点，发挥扩血管、阻滞钙通道、清除自由基、保护线粒体和抗炎等药理作用[14-16]。本研究基于网络药理学的分析结果发现，丹参酮ⅡA、4-亚甲丹参新酮、隐丹参酮、异隐丹参酮和鼠尾草酚酮是丹参发挥抗AD作用的重要活性成分，丹参酮ⅡA在“成分-药效靶点”网络关系图和丹参抗AD作用中处于首要地位(Degree为21)。GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析结果显示，上述活性成分可通过ACHE、FOS、CHRM1、CHRM2和CHRM3等靶点调节神经递质受体活性、核受体活性、乙酰胆碱受体活性、神经递质结合和Aβ结合等分子功能，参与调控hsa04080和hsa04725等与AD生物学机制相关的信号通路，协同抑制Aβ形成和降低Tau蛋白过度磷酸化，发挥抗AD作用。

KEGG通路富集分析结果显示，神经活动配体-受体相互作用通路和胆碱能突触通路是丹参活性成分的作用靶点涉及到的主要信号通路。此外，还涉及到PI3K/Akt信号通路(hsa04151)、cAMP信号通路(hsa04024)、细胞凋亡通路(hsa04210)、AMPK信号通路(hsa04152)和钙通道信号通路(hsa04020)等。研究结果表明，上述信号通路与AD的发病机制密切相关[17-18]。例如，神经活动配体-受体相互作用通路可以调控一系列神经递质包括谷氨酸、血清素和组胺等的表达和活性，这些神经递质在人大脑学习和记忆过程中具有重要作用[19]。PI3K/Akt信号通路可调控线粒体膜通透性蛋白Bcl-2、Bax等蛋白的表达水平，是线粒体损伤学说的重要机制之一。丹参酮ⅡA可通过增强PI3K/Akt信号传导减少超氧化物的生成，减轻线粒体损伤，发挥神经元保护作用[20]。

综上所述，丹参含有的丹参酮ⅡA和隐丹参酮等活性成分可通过神经活动配体-受体相互作用通路、胆碱能突触信号通路等调节乙酰胆碱受体和胆碱酯酶活性，抑制Aβ的积聚和Tau蛋白的过度磷酸化，发挥抗AD作用。本研究尚存在一定局限性，药效靶点的获取方法有待优化。同时，在后续的研究中，有必要从动物或细胞水平进一步验证丹参抗AD的活性成分和完善作用靶点。