薏苡仁油的提取方法、理化性质及脂肪酸结构分析

肖小年，王 凡，易孜成，周 洁，罗俊溢，李 娟，易 醒*

(南昌大学a.中德联合研究院，江西 南昌 330047；b.中德食品工程中心，江西 南昌 330047)

薏苡仁油(Coix seed oil,CSO)是薏苡仁中的主要功能成分，其含量小于10%，具有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖和抗炎消肿等作用[1-2]。含10%薏苡仁油的康莱特注射液，在1995年已正式被国家批准用于抗癌治疗，目前已作为一种较为理想的抗肿瘤药物广泛用于肺癌、肝癌、胃癌、子宫癌等的治疗或辅助治疗。采用传统的压榨法和溶剂法进行提取，所得油的品质不够稳定，损失偏多且存在溶解残留问题。CSO的提取主要采用水酶法[3]、超临界CO2萃取法[4-5]、超声法[6-7]、微波辅助提取法[8]等一些新型技术，其中超临界CO2萃取法不仅降低了提取温度和时间，提高了得油率和品质，而且改善其他提取方法使用有机溶剂的不利因素。目前仍未有选用相同大小、生产批次、品种等的薏苡仁在以上所有工艺下同时提取的研究，因此缺少具有良好对比性的结果对对薏苡仁油的最佳提取方法做出判断。

甘油三酯(Triglyceride,TG)是CSO的基本成分，其羟基结合的脂肪酸(Fatty acid,FA)中C18:1和C18:2含量最为丰富[9]。FA在TG中的位置分布与其双键数目、位置、碳链长短和组成一样决定着脂肪的营养特性[10-12]。董云发[13]等对6种国产薏苡仁的油脂含量及其脂肪酸组成进行了研究，其中含油量介于3.92～6.53%之间，油酸(OA)、亚油酸(LOA)、亚麻酸(LNA)、棕榈酸(PA)等为主要FA。薏苡仁油甘油三酯中不饱和脂肪酸对其稳定性及活性有着重要的影响，但目前为止，有关此方面的研究报道较少。本实验拟用超临界CO2萃取法、水酶法、回流法、超声法和微波法对同一批薏苡仁进行油提取实验，并对其得率和品质进行比较，探讨提取CSO的适宜方法。通过对最适宜提取法制得的CSO进行一般特性的检测以及脂肪酸组成和位置分布分析，为利用和进一步探讨其营养保健特性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

薏苡仁(南昌汇仁集团有限公司)；果胶酶(500 000 U·mL-1)、中性蛋白酶(400 000 U·mL-1，和氏璧生物技术有限公司生产)；液态CO2(纯度99.5%，江西氨厂)；油酸(Fluka公司，纯度≥99%)；亚油酸、胰脂肪酶、甘油三油酸酯(Sigma公司，纯度≥99%)；乙腈、四氢呋喃、正己烷、氯仿、甲醇钠、甲醇、乙酸甲酯(色谱纯，西陇科学有限公司)；石油醚、乙醚(化学纯，天津市永大化学试剂有限公司)；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

1200高效液相色谱仪，6890N型气相色谱仪(美国安捷伦公司)；RE52CS-1旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；HA121-50-01型超临界萃取装置(南通市华安超临界萃取有限公司)；超微粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；DSY-Ⅱ氮吹仪(北京金科科技公司)。

1.3 CSO的提取

采用超临界CO2萃取法提取CSO的具体操作：钢瓶中的CO2经冷凝器液化后进入储罐，经高压泵调节到规定压力，再通过热交换器加热后进入已加有65目薏苡仁颗粒的萃取斧萃取2 h，控制萃取温度45 ℃和萃取压力为20 MPa.萃取物用等量体积的石油醚萃取3次，然后样品经减压回收溶剂后放于通风厨中自然挥干，最后对所得CSO进行称重并计算其得率。

酶法、回流法、超声法和微波法提取CSO，按本课题组先前研究中报道[14]的方法进行。

1.4 含量测定[15]

将CSO(0.1 g)、30% KOH溶液(5 mL)、10%抗坏血酸溶液(2 mL)和无水乙醇(25 mL)混合均匀后进行约1.5 h的回流皂化。然后，皂化液用石油醚进行3次萃取，并将除去石油醚的水层pH调至4.0，以使油酸及亚油酸盐转化为OA和LOA。该水层再用石油醚进行3次萃取，得到的石油醚层经旋转蒸发器蒸干后用CH3CN/THF(4:1，w/w)混合液定容至10 mL。样品中的OA和LOA采用高效液相色谱在30 ℃的C18反相柱中以1.0 mL·min-1流速的乙腈/水/四氢呋喃(含0.4%乙酸，77:20:3，V/V/V)进行分离和测定

1.5 理化特性检测

参照国家相应标准，对CSO的气味、溶解性、相对密度、外观、水分、旋光度、折光系数和含量进行检测。

1.6 薏苡仁油的脂肪酸组成分析

1.6.1 薏苡仁油甘油三酯的纯化

采用硅胶柱层析的方法[16]对薏苡仁油甘油三酯进行纯化，具体操作如下：将适量石油醚/乙醚的混合液(87:13，V/V)和硅胶加入底部填充有少量玻璃棉的层析柱中进行装柱。称取薏苡仁油样品约1.3 g，用洗脱液定容至25 mL配制样品溶液。用约250 mL洗脱液以2 mL·min-1的速度对20 mL样品溶液进行洗脱，并将洗出物中的洗脱液除去，即得纯化的甘油三酯。

1.6.2 胰脂肪酶解

分别取1 mL 0.2 mol·L-1(pH 7.7)的Tris缓冲液、0.1 mL 2.2% CaCl2水溶液、0.25 mL 0.05%胆酸盐水溶液、10 mg纯化后的薏苡仁甘油三酯置于具塞试管中，混匀，水浴1 min(37 ℃)，再加入8 mg胰脂肪酶，混匀后继续水浴25 min[17-18]进行水解。先后用乙醚和水清洗水解液各3次后，加入无水Na2SO4吸收残余水分，再用N2吹除残留的乙醚。将处理后的水解液滴点于硅胶G板上，用甲酸/正己烷/乙醚(75:25:1，V/V/V)将样品中的甘油一酯、甘油二酯和游离脂肪酸进行分离[19]。用碘蒸气对展开样品后的硅胶G板进行显色后，将斑带刮下并用三氯甲烷浸泡提取其中的成分。最后，用N2除去提取液中的三氯甲烷，即得到各斑带中的成分[20]。

1.6.3 气相色谱分析

在室温下，将CSO(1.5 mL，正己烷溶液)、乙酸乙酯(40 μL)和甲醇钠(100 μL)混合均匀并反应约20 min。然后，将60 μL H2C2O4快速加入经10 min冷冻的反应液中，并依次进行离心，弃沉淀和无水Na2SO4除水分操作[16]。处理后的样品进行气相色谱分析，具体条件如下：设定程序升温(在45 ℃维持4 min，再升温至175 ℃并保持27 min，然后升温至215 ℃并保持35 min，前后速度分别为13 ℃和4 ℃·min-1)；采用熔融石英毛细管色谱柱(CP-Sil88，100 m×0.25 nm)；载气为H2；燃烧气为N2、H2和空气混合气。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的比较

对5种方法的提取的得率、所得薏苡仁油的过氧化值及酸价进行比较(表1)，可以评价各方法提取CSO的效果。

表1 5种提取方法比较

油脂品质好坏通常用酸价与过氧化值进行判断，但提取过程中，温度、水分、氧气等因素会对油脂质量造成影响[21]。从表1中可知，超临界CO2萃取法显示出最高的CSO得率，其次是微波法和超声法，回流法最低。采用回流法提取的CSO具有较高的过氧化值，这可能是由于在回流提取时间较长且接触空气的相对面积较大，油脂氧化程度较为严重。除回流法之外，其他方法的过氧化值和酸价几乎相同，保持在一个较低的水平。由于超临界CO2萃取法的温度较低，其可以极大程度保留有效成分[22]，因此该方法提取的油脂质量高且得率可观，为提取CSO的最佳方法。

2.2 理化特性及含量

CSO的多个理化性质指标检测结果如表2所示。其中CSO的折光系数(1.461～1.470)明显高于一般油脂,说明CSO中含有大量带有双键的不饱和脂肪酸[23]。根据已有研究显示，这些不饱和脂肪酸中的油酸与亚油酸是赋予薏苡仁油具有抗癌功效的主要活性成分[25-26]。薏苡仁油中油酸与亚油酸的HPLC示差折光法的谱图如图1所示，并根据油酸(y=127 358x-4 165，R2=0.999 6)与亚油酸(y=139 436x+910.18，R2=0.999 5)的标准曲线方程计算其含量分别为44.1%和28.2%。

表2 薏苡仁油的一般特性

2.3 薏苡仁油甘油三酯中FA分布

2.3.1 脂肪酸组成GC-MS分析

如图2所示，依据保留时间对CSO中含有的FA进行鉴别，并采用面积归一化法计算不同FA的含量(表3)。

由表3可知，CSO中共被分离检测出16种FA，占FA总量的98.588%。主要含有12.854%PA，54.567%OA和27.356%LOA。另外本实验中发现薏苡仁油中含有高等动植物少有的奇数碳链脂肪酸，长链脂肪酸C20～C24含量低于1%。

2.3.2 sn-2位FA分析

由于胰脂酶可以专一性地水解sn-1、3位的FA[26-27]，并在一定条件下不对sn-2位进行水解。通过分析对比水解得到的游离FA成分，可区别TG中sn-1、3位与sn-2位的FA组成，从而确定FA在TG中的具体分布。因此本实验选用胰脂肪酶对提取制得的薏苡仁油进行作用，以研究其TG中FA的位置分布。

结果显示，共16种FA在sn-2位上被鉴定出，UFA含量高达93.032%，其中含有52.614%的PUFA和40.48%的MUFA。另外，SFA含量仅为4.445%，其中主要是3.314%的C16:0。将近半数的C18:1和C18:2均位于sn-2上，说明薏苡仁油甘油三酯中UFA(C18:1、C18:2)主要分布于sn-2位，而sn-1、3位上主要为SFA(C16:0、C18:0)。奇数碳链脂肪酸和长链脂肪酸(C20～C24)则全都分布在sn-1、3位上。

3 结论

传统回流法的CSO得率最低且过氧化值高，油品质较差，而其余四种新方法均可不同程度地提高油得率和品质。其中，超临界CO2萃取法的CSO得率几乎是回流法的3倍，且该方法所得油的质量较好，是目前为止提取CSO的较好方法。采用该方法可得到淡黄色，澄清油状液体且具有特有清香的CSO，水分≤0.5%，相对密度为0.953～0.971，折光系数(n20)为1.461～1.470，旋光度为-2.6°～+3.1°。甘油三酯含量(紫外法)≥91.5%，其中含OA(HPLC示差折光法)≥44.1%，LOA(HPLC示差折光法)≥28.2%。该CSO中共鉴定出16种FA，其中sn-2位上主要为UFA，少量的SAF分布在sn-1、3位上。另外，在sn-1、3位上发现了高等动植物少有的奇数碳链脂肪酸。油脂的脂肪酸组成和分布与其功能性有着密切的关系，而CSO中脂肪酸分布特征是否与其抗癌、降脂、镇痛等生物活性特征有直接或间接的关系，还有待进一步研究。