补阳还五汤对自噬相关蛋白LAMP2 的影响

陈云欢 吴旋 林幸清 汪欣

补阳还五汤，出自清代王清任《医林改错·卷下·瘫痿论》，由生黄芪、当归尾、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙七味中药组成。本方重用黄芪，大补脾胃之元气，使气旺血行，祛瘀通络，并配伍归尾活血养血，使化瘀而不伤血；佐以川芎、赤芍、桃仁、红花活血祛瘀，地龙通络；诸药合用，从而达到气旺则血行，活血而又不伤正[1]。本方在临床上广泛用于治疗脑缺血患者。脑缺血在中医学上属于中风病范畴，气虚血瘀是本病的主要证型，治疗多以益气活血为主[2]。近年研究表明，补阳还五汤能够从多靶点、多通路改善大脑缺血再灌注损伤，提高新生神经元数量，促进神经损伤修复[3-5]。为了探索补阳还五汤对脑缺血后神经功能修复的作用靶点及防治机理，本实验通过构建大鼠脑缺血-再灌注模型，分别采用不同剂量的补阳还五汤进行干预，通过分析自噬-溶酶体信号通路LAMP 蛋白表达变化探讨补阳还五汤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康清洁级雄性成年Wistar 大鼠50 只，体质量约100 ～150g，购自福建中医药大学动物实验中心。随机分成假手术组（145.99±0.81）g、模型组（146.77±0.97）g、补阳还五汤常规剂量组（146.46±1.13）g、补阳还五汤2 倍剂量组（146.35±1.03）g、补阳还五汤10 倍剂量组（147.01±1.12）g，每组10 只。

1.2 主要试剂和仪器

补阳还五汤（购自北京康仁堂药业有限公司），Western 一抗稀释液、Western 二抗稀释液、β-Actin 抗体、Western 转膜液、Western 封闭液、SDS-PAGE 电泳液（碧云天生物科技公司），LAMP2 兔多克隆抗体、二抗HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体（美国PTG 公司），Western blot 电泳设备（Bio-rad 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠脑缺血模型构建 取清洁大鼠，术前禁食12 h，麻醉后，固定头部及四肢，暴露颈部，切开皮肤钝性分离至暴露颈动脉，采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。

1.3.2 补阳还五汤灌胃 50 只大鼠随机分成五组，每组10 只。假手术组：大鼠正常饲养，不进行任何干预；模型组：大鼠造模后不进行任何药物干预；常规剂量组：2.5 g/（kg·只）；2 倍剂量组：5 g/（kg·只）；10 倍剂量组：25 g/（kg·只）。三组大鼠均每天灌胃1 次，造模前灌胃7 天，造模后继续灌胃7 天。

1.3.3 LAMP2 蛋白表达水平 每组随机取5 只大鼠断头取脑，取皮质部分打匀浆，加入裂解液提取细胞总蛋白，置于4℃，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，转移到PVDF 膜，室温封闭2小时。加入一抗，4℃孵育过夜。加入相应二抗，室温孵育2 小时，弃二抗稀释液，洗涤。凝胶成像系统进行显影和目标条带的灰度值分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计学分析。计量资料数据以（±s）表示，两组间的比较采用t检验，两组以上之间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMP2 表达

图1 Western blot 结果显示，与假手术组A 比较，组B 较细浅，组B 到组E 的条带逐渐加深增粗，LAMP2 蛋白表达量呈现递增的趋势。尤其是10 倍剂量组E，两条LAMP2 的蛋白条带已经接近假手术组A 了。假手术组LAMP2 蛋白表达水平明显高于模型组、常规、2 倍及10 倍剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组LAMP2 蛋白表达水平明显低于假手术组、2 倍及10 倍剂量组（P＜0.01），与常规剂量组比较无统计学意义（P=0.230）。常规剂量组与假手术组，10 倍剂量组比较有统计学意义（P＜0.01），与模型组（P=0.230）、2 倍剂量组（P=0.136）比较无统计学意义。10 倍剂量组与假手术组、模型组、常规剂量组比较均有统计学意义（P＜0.01），与2 倍剂量组（P=0.071）比较无统计学意义。F=38.03，详见表1。

图1 LAMP2 蛋白表达（A：假手术组；B：模型组；C：常规剂量组；D：2 倍剂量组；E：10 倍剂量组）

表1 各组LAMP2 蛋白表达水平的比较（±s）

表1 各组LAMP2 蛋白表达水平的比较（±s）

注：与假手术组比较，aP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.01；与常规剂量组比较，cP ＜0.01；与10 倍剂量组比较，dP ＜0.01

组别 例数 LAMP2 假手术组 模型组 常规剂量组2 倍剂量组10 倍剂量组1.00±0.00bcd 0.53±0.09ad 0.60±0.08ad 0.67±0.05ab 0.75±0.07abc 5 5 5 5 5

3 讨论

脑缺血是一种死亡率和致残率都较高的多因素疾病，尤其是对老年人的伤害比较严重。脑缺血发病率高，预后差，带来的伤残甚至死亡会给患者自身、家庭、社会都带来沉重的负担。在现代的中西医治疗中，均以疏通脑血栓、活血化瘀为原则。中药方剂补阳还五汤是治疗缺血中风的有效方剂，具有补气、活血、通络之效，主要治疗由缺血性脑病、中风后遗症等引起的半身不遂，肢体麻木，口眼歪斜等症状[6-7]。

研究表明，局灶性脑缺血损伤能活化自噬/溶酶体途径，可致皮质区和海马区的自噬体增多进而引起该区域溶酶体活性的增加[8-9]。自噬溶酶体系统能对自身胞质内的异物、损伤和衰老细胞器进行吞噬降解，以使细胞内的各种能量物质循环再利用进而维持细胞内环境的稳态，保证细胞正常生长和器官正常发育。自噬分为大自噬、小自噬、CMA，LAMP-2 蛋白是参与CMA 的关键分子。LAMP-2 是溶酶体膜上的单次跨膜蛋白，是一种重度糖基化1 型膜蛋白，与分子伴侣性自噬直接相关[10]。当细胞受到氧化性损伤时，细胞内蛋白暴露出KFERQ 序列，被作为分子伴侣的Hsc70 识别，形成分子伴侣-底物复合物，该复合物与溶酶体膜上的LAMP-2a结合，随后溶酶体内的Lys-Hsc70 运送损伤蛋白质进入溶酶体内降解的过程，此过程为CMA。LAMP2a 在溶酶体膜上的表达水平直接决定了CMA 活性[11-12]。本实验研究结果表明，假手术组的LAMP2 的蛋白表达量明显高于其余各组（P ＜0.01），模型组的LAMP2 的蛋白表达低于假手术组、2 倍及10 倍剂量组（P ＜0.01），与常规剂量组的比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。从结果看，常规剂量治疗基本无效；2 倍剂量效果尚不明确，具体确定疗效可能需要进一步增加样本数；10 倍剂量治疗效果肯定，但依旧低于假手术组，说明治疗效果无法完全恢复正常。从实验结果推测，补阳还五汤可能通过上调LAMP2 蛋白的表达使CMA 活性上调，CMA 活性上调在脑缺血时可选择性地清除某些错误编辑的蛋白或受损的细胞器，维持神经细胞内环境的稳定，促进神经干细胞分化为神经细胞，帮助神经功能恢复，进而发挥神经保护作用。

本研究探讨了补阳还五汤通过上调LAMP2 蛋白去激活可能存在的CMA 自噬途径，揭示了补阳还五汤对脑缺血发挥神经保护作用的潜在新机制，但如何上调，如何激活的确切机制尚需进一步研究。如进一步通过电镜观察受损神经元是否有增加的自噬体出现，补阳还五汤治疗后自噬体数量和超微结构的变化过程；保护脑缺血的自噬途径信号通路中上、下游分子的作用等都还有待深入阐明，从而为预防和治疗缺血性脑血管疾病提供更有效的作用靶点，为中医药防治疾病提供细胞层面的微观依据。