柴胡桂枝汤挥发油的GC-MS分析及对人肺腺癌A549细胞体外增殖的抑制作用研究

文冉 李壮壮 杜以晴 杨勇 容蓉 吕青涛

摘 要 目的：研究复方柴胡桂枝汤挥发油的组成成分，并评价其对人肺腺癌A549细胞体外增殖的抑制作用。方法：根据2015年版《中国药典》（四部）通则2204挥发油测定法中甲法提取柴胡桂枝汤中的挥发油。采用气相色谱-质谱聯用法（GC-MS）结合Kováts指数分析其挥发油成分，并采用峰面积归一化法计算各成分的相对含量。以不同质量浓度顺铂（4、8、16、32、64 mg/L）为阳性对照，采用MTT法检测不同质量浓度柴胡桂枝汤挥发油（25、50、100、200、400 mg/L）作用48 h后对A549细胞体外增殖的抑制作用;另设阴性对照组（加细胞但不加药物）。结果：从挥发油中共分离出71个成分，鉴定出其中59个成分，其峰面积之和占总峰面积的84.99%。其中，相对含量较高的成分为芳姜黄烯（17.65%）、β-甜没药烯（9.57%）、β-罗勒烯（7.05%）、α-姜黄烯（5.35%）、  2，5-二甲基苯甲醛（4.24%）、异丁酸芳樟酯（2.70%）、α-雪松烯（2.48%）、δ-杜松烯（2.07%）。与阴性对照组比较，4～64 mg/L顺铂组和25～400 mg/L柴胡桂枝汤挥发油组细胞的增殖率均显著降低（P<0.05）;顺铂和柴胡桂枝汤挥发油对A549细胞体外增殖的半数抑制浓度分别为10.150、73.526 mg/L。结论：柴胡桂枝汤挥发油中主要以芳姜黄烯、β-甜没药烯、β-罗勒烯、α-姜黄烯等成分为主，其对A549细胞的体外增殖具有一定的抑制作用。

关键词 柴胡桂枝汤;挥发油;气相色谱-质谱联用法;Kováts指数;人肺腺癌A549细胞

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the composition of the volatile oil from Compound chaihu guizhi decoction， and to evaluate its in vitro anti-proliferative activity on human lung adenocarcinoma A549 cells. METHODS： The volatile oil from Chaihu guizhi decoction was extracted according to the steam distillation method of general rules 2004 in the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅳ）. The volatile oil components were analyzed by GC-MS combined with Kováts index， and the relative content of each component was calculated by peak area normalization method. Using different concentrations of cisplatin （4， 8， 16， 32， 64 mg/L） as positive control， MTT assay was used to detect the inhibitory effects of different concentrations of volatile oil from Chaihu guizhi decoction （25， 50， 100， 200， 400 mg/L） on in vitro proliferation of A549 cell after 48 h of treatment. Negative control group （with cells but without drugs） was set up. RESULTS： A total of 71 chemical components were isolated from the volatile oil， among which there were 59 compounds identified， sum of peak areas accounting for 84.99% of the total peak area. The compounds with relatively high content included ar-curcumene （17.65%）， β-bisabolene （9.57%）， β-ocimene （7.05%）， α-curcumene （5.35%）， 2，5-dimethylbenzaldehyde （4.24%）， linalyl isobutyrate （2.70%）， α-cedrene （2.48%）， δ-cadinene （2.07%）. Compared with negative control group， the proliferation rate of cells were decreased significantly in 4-64 mg/L cisplatin groups and 25-400 mg/L volatile oil from Chaihu guizhi decoction groups （P<0.05）. IC50 of cisplatin and volatile oil from Chaihu guizhi decoction to in vitro proliferation of A549 cells were 10.150 and 73.526 mg/L. CONCLUSIONS： The volatile oil from Chaihu guizhi decoction mainly includes ar-curcumene， β-bisabolene， β-ocimene， α-curcumene， which shows certain inhibitory effect on  in vitro proliferation of A549 cells.

KEYWORDS   Chaihu guizhi decoction; Volatile oil; GC-MS; Kováts index; Human lung adenocarcinoma A549 cells

柴胡桂枝汤出自《伤寒论》，为东汉末年中医名家张仲景创立的经典方剂，由小柴胡汤和桂枝汤加减而来，全方由柴胡、桂枝、黄芩、人参、甘草、半夏、生姜、芍药、大枣共9味中药组成[1]。随着人们对经方的深入研究，发现柴胡桂枝汤在现代临床可用于治疗呼吸系统类、神经系统类、消化系统类和运动系统类等疾病，如其在感冒[2]、失眠[3]、抑郁症[4]、功能性消化不良[5]、颈椎病[6]等的治疗中具有独特优势。另有报道发现，柴胡桂枝汤中桂枝的挥发性成分桂皮醛联合热疗，可通过调控活性氧和丝裂原活化蛋白激酶家族来诱导非小细胞肺癌A549细胞的凋亡[7];生姜中的8-姜辣素可通过表皮生长因子/信号转导与转录活化因子/细胞外调节蛋白激酶通路来调节结直肠癌细胞的增殖和迁移[8]，而生姜中的6-姜辣素可通过诱导细胞周期阻滞、活性氧的产生和线粒体膜电位的破坏从而促进人胃癌（AGS）细胞的凋亡[9]。由此可见，柴胡桂枝汤挥发油的单一成分具有一定的抗癌药效。那么，柴胡桂枝汤挥发油是否具有体外抗癌作用值得探究，加之目前针对柴胡桂枝汤挥发油组成的基础研究较少，故本研究采用气相色谱-质谱法（GC-MS）对柴胡桂枝汤挥发油的成分进行分析，结合Kováts指数（KI值）对挥发油组分进行准确定性，为柴胡桂枝汤挥发油组成成分的研究提供基础数据，同时评价该挥发油对人肺腺癌A549细胞体外增殖的抑制作用，旨在为柴胡桂枝汤的进一步开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

7000B型三重四极杆GC-MS联用仪（美国Agilent公司）;AE240型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）;热电Thermo MK3酶标仪（上海赛默飞生物有限公司）;HF90型CO2恒温培养箱（上海力申科学仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

柴胡（批号：17090609）、桂枝（批号：17092603）、黄芩（批号：17041516）、甘草（批号：17082005）、生姜（批号：17030803）、人参（批号：17031503）、大枣（批号：17052411）、半夏（批号：17071501）、白芍（批号：17072801）等饮片均购自山东省中医院，由山东中医药大学药学院李峰教授鉴定均符合2015年版《中国药典》（一部）标准;注射用顺铂（山东齐鲁制药有限公司，批号：H37021358，规格：20 mg）;正构烷烃混合标准品C8～C36（美国Sigma-Aidrich公司，批号：11521014，纯度：≥98%）;MTT试剂（江苏凯基生物技术有限公司，批号：14069927）;胎牛血清（FBS，美国HyClone公司，批号：LT22906）;DMEM高糖培养基（美国Gibco公司，批号：8118192）;二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝科技有限公司，批号：6768521）;其余试剂均为分析纯，水为自制双蒸水。

1.3 细胞

人肺腺癌细胞株A549购自山东省中医院。

2 方法

2.1 柴胡桂枝汤挥发油的提取

取柴胡桂枝汤处方10倍量的药材，粉碎后过三号筛，加入8倍质量水，按2015年版《中国药典》（四部）通则2204挥发油测定法中甲法[10]提取该复方中的挥发油。加热回流提取8 h后，冷却，收集挥发油，经无水硫酸钠干燥后，称质量并计算其得率（挥发油质量/药材总质量×100%）为1.12%。

2.2 溶液的制备

2.2.1 挥发油样品溶液 取挥发油样品适量，用三氯甲烷稀释成质量浓度为65 g/L的溶液（以挥发油质量计），作为样品溶液，待GC-MS进样分析。

2.2.2 正构烷烃C8～C36标准品溶液 取正构烷烃标准品C8～C36适量，加三氯甲烷稀釋成5 mg/L的标准品溶液，待GC-MS进样分析。

2.2.3 体外增殖试验挥发油母液 取挥发油样品适量，用DMSO稀释，制备成质量浓度为35 g/L（以挥发油质量计）的溶液，作为体外抗增殖试验的母液。

2.3 柴胡桂枝汤挥发油的GC-MS分析

2.3.1 GC条件 石英毛细管色谱柱：Agilent HP-5 MS（250 μm×0.25 μm，30 m）;载气：氦气（纯度为99.999%）：载气流速：1.0 mL/min;载气压力：7.652 2 psi;隔膜吹扫速率：1 mL/min;进样口温度：250 ℃;升温程序：初始温度100 ℃并保持10 min，以2 ℃/min速率升至150 ℃并保持15 min，再以2 ℃/min速率升至280 ℃并保持18 min;进样量：1.0 μL;分流比：20 ∶ 1;溶剂延迟时间：3 min。

2.3.2 MS条件 离子源：电子轰击源（EI）;离子源温度：230 ℃;电离能量：70 eV;传输线温度：280 ℃;扫描范围：质荷比（m/z）35～1 000。

2.3.3 样品分析 在全扫描（SCAN）检测模式下，分别取“2.2.1”项下挥发油样品溶液和“2.2.2”项下正构烷烃C8～C36标准品溶液，按“2.3.1”“2.3.2”项下条件进样分析，记录总离子流图。根据 Vanden Dool 和 Kratz 线性程序升温的KI原理，利用公式求得各成分的KI值[KI=100n+100（tx-tn）/（tn+1-tn），式中n为碳原子数，tx为被分析组分x的保留时间，tn、tn+1分别为碳原子数为n和n+1的正构烷烃标准品的保留时间]，并与NIST 11质谱库中检索得到的KI值进行比对，从而对挥发油成分进行定性分析，最后通过峰面积归一化法计算各组分的相对含量。

2.4 柴胡桂枝汤挥发油对A549细胞体外增殖的抑制作用考察

将处于对数生长期的A549细胞制备成5×104个/mL的单细胞悬液，以100 μL/孔接种于96孔培养板中（取2块培养板，分别用来考察顺铂和柴胡桂枝汤挥发油的体外增殖抑制作用），将细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h待细胞贴壁后，弃上清，然后将细胞分为顺铂组、柴胡桂枝汤挥发油组（分别用1块板），试验均设阴性对照组。顺铂组分别添加含10%FBS和不同质量浓度顺铂（4、8、16、32、64 mg/L，剂量参考文献[11]设置）的DMEM培养基，柴胡桂枝汤挥发油组分别添加含10%FBS和不同质量浓度挥发油（25、50、100、200、400 mg/L，以挥发油质量计，剂量由前期试验摸索得出）的DMEM培养基，阴性对照组仅加入含10%FBS和0.1%DMSO的DMEM培养基（记为0 mg/L组），并另设不含细胞但加入含10%FBS和0.1%DMSO的DMEM培养基的空白对照组，每组均设置5个复孔。加药后，将各组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养48 h，再在每孔避光加入MTT溶液（5 mg/mL）10 μL，继续培养4 h，弃上清;每孔加入DMSO溶液150 μL，于摇床上振摇15 min，采用酶标仪测定490 nm波长处各孔的吸光度（A），计算各组细胞的增殖抑制率[增殖抑制率=（A阴性对照-  A挥发油）/（A阴性对照-A空白对照）×100%]，并采用GraphPad Prism 7.00软件计算药物的半数抑制浓度（IC50）。试验重复3次。

2.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。试验数据用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 柴胡桂枝汤挥发油成分的GC-MS分析结果

在柴胡桂枝汤挥发油中共分离出71个成分，通过质谱库检索和人工图谱解析，并结合KI值比对，初步鉴定了其中59个挥发性成分，占挥发油总峰面积的84.99%，包括烯烃类成分（序号1～18的化合物）的相对含量总和为51.47%、醛类成分（序号19～33的化合物）的相对含量总和为13.62%、醇类成分（序号34～43的化合物）的相对含量总和为5.29%、酯类成分（序号44～49的化合物）的相对含量总和为6.68%、酸类成分（序号50～53的化合物）的相对含量总和为2.14%、酚类成分（序号54～55的化合物）的相对含量总和为0.77%、其他类成分（序号56～59的化合物）的相对含量总和为5.03%。其中，含量较高的化合物为芳姜黄烯（17.65%）、β-甜没药烯（9.57%）、β-罗勒烯（7.05%）、α-姜黄烯（5.35%）、2，5-二甲基苯甲醛（4.24%）、异丁酸芳樟酯（2.70%）、α-雪松烯（2.48%）、δ-杜松烯（2.07%）。正构烷烃混合标准品总离子流图见图1，柴胡桂枝汤挥发油总离子流图见图2，柴胡桂枝汤挥发油成分鉴定和相对含量测定结果见表1。

3.2 柴胡桂枝汤挥发油对A549细胞体外增殖的抑制作用

与阴性对照组比较，顺铂不同质量浓度组和柴胡桂枝汤挥发油不同质量浓度组细胞的增殖抑制率均显著升高（P<0.05），且均呈一定的浓度依赖趋势。经计算，顺铂和柴胡桂枝汤挥发油对A549细胞体外增殖的IC50分别为10.150、73.526 mg/L。各组细胞的体外增殖抑制率测定结果见表2。

4 讨论

柴胡桂枝汤由9味中药组成，化学构成复杂，其挥发油中同系物及同分异构体众多，单凭质谱检索数据库无法达到较高匹配度。KI值是一种重现性较好的定性参数，仅与固定相的性质、柱温有关[12]。黄庆晖等[13]采用超临界流体萃取法提取柴胡桂枝汤中的挥发油，依靠质谱数据库检索比对鉴定出挥发油中28种成分，占挥发油总成分的85%。本研究采用2015年版《中国药典》（四部）通则2204挥发油测定法中甲法提取柴胡桂枝汤中的挥发油，采用GC-MS法测定并结合KI值对挥发油组分进行定性分析，共鉴定出了其中59个成分，其峰面积之和占总峰面积的84.99%。相比之下，本研究更能够对挥发油中更多组分进行表征。虽然超临界流体萃取法与传统提取方法相比，不残留有机溶剂、萃取速度快，但其局限性为设备造价高、对脂溶性成分溶解能力强、对水溶性成分溶解能力差。相比而言，按挥发油测定法中甲法提取挥发油的成本低廉，并且更贴近柴胡桂枝汤水煎服的用药方式。

近年來，多采用放化疗、靶向药物等手段治疗肺癌。顺铂是一种细胞周期非特异性的抗肿瘤药物，同时也是目前应用最广泛的实体瘤治疗药物之一[14]，故本研究以顺铂为阳性对照药物来考察柴胡桂枝汤挥发油对A549细胞体外增殖的影响。本研究结果显示，柴胡桂枝汤挥发油对A549细胞的体外增殖具有一定的抑制作用，该作用虽不及顺铂（IC50明显高于顺铂），但考虑到顺铂在肿瘤的治疗过程中易产生耐受现象，且对肝脏毒副作用大[15]，因此寻求有效、低毒的天然抗肿瘤药物仍有重要意义。

从《伤寒论》首载柴胡桂枝汤，到现代临床的古方新用，该方的适用范围逐渐扩大，其在神志病治疗方面也得到了运用[16]。目前有临床报道称，柴胡桂枝汤挥发油可能通过降低兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸的比值、增强自由基清除能力、阻止过氧化物生成以及减少一氧化氮（NO）神经毒性来发挥抗癫痫作用[17-18]。柴胡桂枝汤挥发油组分较多，其中姜辣素类成分在柴胡桂枝汤挥发油定性分析结果中有体现且占比较大。有研究指出，柴胡桂枝汤挥发油中的姜辣素、单萜类、丁香酚等主要成分在抗氧化与抗癫痫过程中可能发挥了一定的作用[19]。并且，姜辣素能够调节与癌症有关的多种细胞信号通路，包括核因子κB（NF-κB）、信号转导子和转录激活因子3（STAT3）、激活蛋白1（AP-1）、β-连环蛋白、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和促炎介质肿瘤坏死因子α（TNF-α）、环氧合酶2（COX-2）等，发挥其体内外抗癌作用[20]。据报道，在乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型中，6-姜辣素可诱导小鼠肺组织中抗原重组蛋白1（MSR1）、脂肪酸受体蛋白36（CD36）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达，升高肺泡细胞因子γ-干扰素（IFN-γ）和白细胞介素12（IL-12）的水平，降低IL-10和转化生长因子β1（TGF-β1）的水平，增加M1巨噬细胞比例，降低M2巨噬细胞比例，减少肺部肿瘤结节数和直径，改善肺组织病理结构异常[21]。由此也可推测，姜辣素类成分或为柴胡桂枝汤挥发油抑制肺癌细胞A549增殖的潜在活性成分之一。