天麻素对戊四氮致痫模型大鼠的治疗作用及对细胞自噬、凋亡机制的研究

翁柠，况时祥，薛红，何前松，王强，刘建辉，赵芝兰，李艳

癫痫是大脑神经元突发性异常放电，导致大脑功能障碍的一种慢性疾病[1]。癫痫的病因复杂多样，常见的有遗传因素、脑部疾病、全身性或系统性疾病[2-3]。其中先天及围产期因素、遗传代谢性疾病、皮质发育异常所致的畸形等病因多发生于新生儿及婴儿期；而特发性、中枢神经系统感染、脑发育异常等多发生于儿童及青春期；头颅外伤、脑肿瘤、中枢神经系统感染性因素等多发生于成人期；脑血管意外、脑肿瘤、代谢性疾病、变性病等则多发生于老年期[4-5]。根据我国最新流行病学资料显示，国内癫痫病患者日益增加，已经发展成为神经科内仅次于头痛的第二大常见病[6-7]。因此，本研究建立戊四氮致痫大鼠模型，积极探索癫痫的发病机制及癫痫的有效治疗药物，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物： Wistar健康雄性大鼠(购于三峡大学动物实验中心)120只，体质量160～220(180.50±37.52)g，于室温24℃、湿度45%的干净笼子里喂养，饮水和饲料均进行消毒之后自由食用。(2)试剂试药：天麻素(源叶生物公司生产)、戊四氮(PTZ)(Sigma公司生产)、10%水合氯醛(上海雅吉生物科技有限公司生产)，PBS缓冲液(国药集团化学试剂有限公司生产)，蛋白缓冲液(上海谷研实业有限公司生产)，TBST液(国药集团化学试剂有限公司生产)，4%多聚甲醛(临沂盛阳化工有限公司生产)，兔抗小鼠Bax抗体(Selleck公司生产)，大鼠抗兔Beclin1抗体(CiteAbc公司生产)，大鼠抗小鼠Caspase-3(Abcom生产)，兔抗大鼠LC3抗体(Bioworld生产)。(3)仪器设备：光学显微镜(BX53型，OLYMPUS，奥林巴斯株式会社生产)，电泳仪(型号 YQDL001/YQDL002，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品)，成像仪(型号 Lux2 ，普迈精医科技有限公司产品)。

1.2 实验方法 2018年11月—2019年11月于贵州中医药大学实验室进行实验。

1.2.1 癫痫模型制作：大鼠自由饮水和摄食5 d后，使用戊四氮(32 mg·kg-1·d-1)+生理盐水配制成浓度为2.5 mg/L溶液腹腔注射,每日清晨注射1次，每次给药后观察30 min,连续注射28 d；停药7 d后，再次同样使用PTZ亚惊厥剂量32 mg·kg-1·d-1+生理盐水配制成浓度为2.5 mg/L溶液腹腔注射,每日清晨注射1次，连续5 d。根据Racine分级法对大鼠行为惊厥评分分级，凡连续4次出现2级以上发作或者连续出现2次5级痫性发作即判定该鼠被点燃，视为造模成功。通过筛选将造模成功的100只癫痫模型大鼠以随机数字表法分为戊四氮致痫模型组、丙戊酸钠(VPA)干预组、天麻素小剂量干预组、天麻素中剂量干预组、天麻素大剂量干预组，每组20只，另外20只为正常对照组，共120只。造模成功后除正常对照组外，各组均予维持量PTZ(20 mg·kg-1·d-1)腹腔注射维持痫性发作。在腹腔注射PTZ之前2 h，模型组腹腔注射生理盐水,天麻素小、中、大剂量干预组分别于大鼠腹腔注射天麻素30、60、120 mg·kg-1·d-1，丙戊酸钠干预组于大鼠腹腔内注射丙戊酸钠(120 mg·kg-1·d-1)，共治疗14 d。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 脑组织取材：当大鼠造模成功并干预2周后，取其脑海马组织进行切片(统一取左侧海马组织)，大鼠造模最后一次注药1 d后，采用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉之后断头取脑，脑组织放在冰盘内沿矢状缝对切，左侧海马区组织使用4%多聚甲醛进行固定，然后进行脱水、浸蜡后包埋，以备切片。

1.3.2 免疫组化检测微管相关蛋白轻链(LC3)、Bax表达：对大鼠海马组织石蜡切片行脱蜡、脱水等处理后，浸泡于0.01 mol/L、95℃的枸橼酸缓冲液中，并进行热修复，3% H2O2环境下培育10 min，滴入山羊血清，26℃环境中培养30 min，抽离封闭液、添加一抗，将其置于5℃环境中过夜培养，次日加入二抗，37℃恒温箱中培养30 min，清洗后进行封片。LC3、Bax阳性表达为棕黄色或黄色细颗粒状，使用半定量评分法对染色结果进行评定，每切片取10个高倍视野，取其平均值为最终判定结果。

1.3.3 Western-blot法检测自噬相关蛋白(Beclin1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达：首先使用PBS缓冲液对海马区组织标本进行冲洗，随后裂解30 min，裂解后测定其蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质进行电泳，电泳的同时加入蛋白缓冲液，10 min后把电转膜放置到浓度为10%牛奶中进行浸泡，常温环境下封闭2 h。封闭后结合一抗孵育1 d，第2天取出后使用TBST液进行冲洗，随后结合二抗。1 h后进行清洗、显色，对Beclin1、Caspase-3表达进行检测。

1.3.4 TUNEL法检测海马区细胞凋亡率：海马组织于常温环境中使用20 μg/ml蛋白酶K培养0.5 h后去除蛋白，使用PBS缓冲液进行彻底清洗，将平衡缓冲液100 μl加入其中，室温环境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反应液100 μl，避光、室温环境中孵育1 h，之后加入SSC溶液100 μl，常温环境中静置20 min后进行清洗3次，使用DAPI进行复染，滴加DAPI避光孵育 5 min，对标本进行染核，PBST 洗去多余的DAPI。用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。荧光显微镜下组织切片中凋亡的细胞呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。取每切片3个视野进行观察、计算细胞凋亡率。

2 结 果

2.1 大鼠存活情况 实验过程中，模型组大鼠死亡2只，天麻素小剂量组死亡2只，天麻素中剂量、大剂量组及丙戊酸钠干预组死亡各1只，最终存活大鼠113只。

2.2 各组大鼠脑组织LC3、Bax表达比较 与正常对照组比较，模型组LC3、Bax表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，天麻素各剂量组、丙戊酸钠干预组LC3、Bax表达量表达均下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与丙戊酸钠干预组比较，天麻素小剂量、中剂量组LC3、Bax表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，天麻素大剂量组LC3、Bax表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；LC3、Bax表达量在天麻素小、中、大剂量各组间依次下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1、2。

表1 各组大鼠脑组织LC3、Bax表达比较

2.3 各组大鼠脑组织Beclin1、Caspase-3表达比较 与正常对照组比较，模型组Beclin1、Caspase-3表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，天麻素各剂量组、丙戊酸钠干预组Beclin1、Caspase-3表达量均下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与丙戊酸钠干预组比较，天麻素小剂量、中剂量组脑组织Beclin1、Caspase-3表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，天麻素大剂量组Beclin1、Caspase-3表达量差异无统计学意义(P>0.05)；Beclin1、Caspase-3表达量在天麻素小、中、大剂量各组间依次下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2、图3。

表2 各组大鼠脑组织Beclin1、Caspase-3相对表达量比较

图1 各组大鼠海马区LC3表达比较(免疫组化染色，×400)

图2 各组大鼠海马区Bax表达比较(免疫组化染色， ×200)

注：A.正常对照组；B.模型组；C.天麻素小剂量组；D：天麻素中剂量组；E：天麻素大剂量组；F：丙戊酸钠干预组

2.4 各组大鼠海马区细胞凋亡率比较 与正常对照组(2.91±0.53)% 比较，模型组海马区细胞凋亡率[(58.77±4.52)%]升高(t=54.930，P=0.001)；与模型组比较，天麻素小剂量组(21.58±2.71)%、天麻素中剂量组(12.74±2.10)%、天麻素大剂量组(9.19±1.88)%、丙戊酸钠干预组(9.21±1.85)%,海马区细胞凋亡率依次降低，差异均有统计学意义(F=20.591 ，P=0.031)；而丙戊酸钠干预组海马区细胞凋亡率与天麻素大剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

3 讨 论

天麻是著名的中药材，润而不燥，主入肝经，长于平肝息风，其性辛、温、无毒，有抗癫痫、抗惊厥、镇静、镇痉、镇痛、平肝息风的功效。天麻主要含天麻素、天麻醚苷、天麻多糖、对羟基苯甲醇、香荚兰素、蛋白质、氨基酸、微量元素等多种成分，其中天麻素是天麻的主要活性成分，其含量高低是天麻质量的重要指标。天麻素能够扩张脑血管、提高脑细胞抗缺氧能力、增加脑血流量，对神经细胞进行保护，清除过多的自由基，增强巨噬细胞的吞噬功能等[8-9]。戊四氮又称卡地阿唑，一种白色结晶的粉末状化学品，为中枢兴奋药[10],也是研究较多的癫痫动物模型诱导药之一。癫痫是一种反复发作的慢性脑部疾病，其有着反复性和短暂性的特点[11-12]。迄今为止，仍有部分难治性癫痫患者无法得到治愈。所以研究癫痫的发病机制及治疗癫痫的新型药物，具有重要意义。

癫痫的发病机制至今尚未完全明确，近年来研究认为，癫痫发生与海马区细胞程序性死亡如凋亡与自噬密切相关[13-14]。细胞的过度自噬反而会加重细胞损伤程度，严重的可能会致使细胞死亡[15-16]。细胞自噬是形成双层膜的自噬泡，将细胞质内的物质包裹起来，然后通过溶酶体融合并消化掉的过程。LC3是酵母自噬相关基因8，主要存在于哺乳动物中，在自噬体的形成阶段，LC3-Ⅰ被包括Atg3和Atg7在内的泛素样体系修饰加工，转变为LC3-Ⅱ，并定位到自噬小体中。自噬小体中的LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ都可以作为细胞发生自噬的分子标志，同时LC3-Ⅱ的水平与自噬表达程度呈正相关，因此LC3可以作为自噬水平的检测指标。Bax属于兔抗人单克隆抗体，是与Bcl-2同源的水溶性相关蛋白，是Bcl-2基因家族中细胞凋亡促进基因，Bax的过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于死亡[17-19]。自噬相关蛋白Beclin1不仅能够促进真核细胞的自噬，同时还参加了细胞的凋亡调节。吴琼等[20]在研究中指出，癫痫模型大鼠体内自噬相关蛋白Beclin1表达异常升高，说明Beclin1表达能反映大鼠海马神经元的自噬活动。Caspase-3为一种蛋白酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的核心酶，大多数学者认为Caspase-3的出现是细胞凋亡的标志[21-22]。当炎性因子和信号蛋白相应激活Caspase-8后会引起级联反应，从而激活Caspase-3引起细胞的凋亡。有研究报道，Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)杀伤机制的重要组成部分[23-24]。

综上，天麻素能调控戊四氮致痫模型大鼠海马区细胞凋亡、自噬相关因子LC3、Bax、Caspase3、Beclin1等表达，提示天麻素可通过调节凋亡、自噬发挥神经保护作用，抑制癫痫发作，为临床治疗提供一定的理论依据。

图4 各组大鼠细胞凋亡率比较(荧光染色,×200)

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

翁柠：提出研究方向、研究思路，研究选题，论文撰写，论文修改审核；况时祥：研究选题分析，论文修改；薛红：设计论文框架，分析试验数据;何前松：进行文献调研与整理；王强：进行统计学分析；刘建辉：实验数据统计分析；赵芝兰、李艳：实施研究过程