芪苈强心胶囊通过TLR4/NF-κB通路减轻大鼠心肌炎性反应及损伤

马小林,黄政,方存明,胡学俊,刘冰,伍超,龚天奎,丁文龙

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是威胁人类生命健康的常见病和多发病。随着急诊介入技术的逐渐推广，急性心肌梗死患者的预后得到了极大改善。然而，仍有相当数量的急性心肌梗死患者不能得到及时有效地再灌注治疗。心肌梗死后大量心肌细胞的丢失导致急性心力衰竭、心源性休克、恶性心律失常、猝死等严重并发症发生。心肌梗死后心室重构亦可导致心功能减退和慢性心力衰竭发生。研究发现，炎性反应的过度激活可诱导心肌细胞凋亡、坏死，促进心室重构和心力衰竭发生[1-2]。因此，抑制免疫炎性反应对改善心肌梗死患者心功能和预后具有重要意义。研究证实芪苈强心胶囊能有效抑制心室重构、缓解心力衰竭症状并改善心力衰竭预后[3-4]。抑制免疫炎性反应可能是芪苈强心胶囊治疗心力衰竭的机制之一。现观察芪苈强心胶囊对心肌梗死大鼠心肌Toll样受体-4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响及其对缺血心肌的保护作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 (1)动物：SPF级雄性SD大鼠32只，体质量(230±20)g，购自皖南医学院。大鼠在室温(22±2)℃、湿度50%～60%、12 h光照/12 h黑暗节律的环境下饲养。(2)试药试剂：芪苈强心胶囊(石家庄以岭药业股份有限公司生产)；卡托普利(常州制药厂生产);青霉素(石药控股集团有限公司生产) ； 大鼠TLR4、NF-κB p65、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、β-actin抗体购自北京博奥森生物科技有限公司，HE染色、TUNEL染色试剂盒购自上海碧云天生物公司。(3)仪器设备：小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司，型号ALC-V8S)，心电图仪(上海光电医用电子仪器有限公司，型号ECG2250)，显微镜[奥林巴斯(中国)有限公司，型号IX73]，离心机[艾本德(上海)国际贸易有限公司，型号5804R]，扫膜仪(美国Licor公司，型号Odyssey CLx)。

1.2 实验方法 2019年4—6月于宣城市人民医院病理科进行实验。 将SD大鼠32只随机数字表法分为假手术组、MI组、MI+芪苈强心组、MI+卡托普利组，每组8只。大鼠以1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，气管插管成功后连接小动物呼吸机，设置吸呼比1∶2，潮气量0.7～0.8 ml，呼吸频率80次/min。于大鼠左胸第3～4肋间开胸，暴露心脏，在左心耳与肺动脉之间下约1 mm处结扎冠状动脉。当结扎部位以下心肌变灰白，心电图肢体导联出现ST段弓背向上抬高时提示冠状动脉结扎成功。迅速缝合切口、关胸。术后3 d予青霉素20万U/d腹腔注射预防感染。假手术组大鼠手术过程同上，但只穿线不结扎冠状动脉。将芪苈强心胶囊药粉以生理盐水配制成0.1 g/ml浓度溶液。参考林锐波等[5]研究方法，MI+芪苈强心组以芪苈强心胶囊溶液1.2 g·kg-1·d-1，MI+卡托普利组以卡托普利25 mg·kg-1·d-1。假手术组、MI组以生理盐水10 ml·kg-1·d-1，均每日1次灌胃2周。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 心肌病理学检测：大鼠给药2周后采用颈椎脱臼法处死，开胸取心肌梗死区心肌组织，PBS溶液清洗后以4%多聚甲醛4℃固定24 h，常规石蜡包埋、切片。采用HE染色观察各组心肌形态、结构变化及炎细胞浸润情况，TUNEL染色检测各组心肌细胞凋亡情况。所有操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 Western-blot检测TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表达：取大鼠心肌组织40 mg加入RIPA裂解液充分匀浆、裂解。裂解液4℃下，离心后吸取上清，采用BCA法测定蛋白浓度；取等量蛋白上样，SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗溶液(浓度1∶1 000)中4℃摇匀过夜，再加入二抗溶液室温孵育2 h；经洗涤、显影、灰度扫描后，用 Odyssey 3.0软件对蛋白条带进行灰度值测定，以目的条带与β-actin的灰度比值表示TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌结构变化比较 假手术组心肌纤维排列整齐，细胞核大小、形态一致，心肌间隙正常，无炎性细胞浸润。MI组心肌纤维排列紊乱，可见心肌纤维断裂，核深染，心肌间隙明显增宽，或伴炎性细胞浸润。与MI组比较，MI+芪苈强心组及MI+卡托普利组心肌纤维排列较为整齐，心肌纤维破坏减轻，心肌间隙减小，炎性细胞浸润减少，见图1。

2.2 各组大鼠心肌TLR4、NF-κB蛋白表达比较 Western-blot检测结果显示，与假手术组比较，MI组大鼠心肌TLR4、NF-κB p65蛋白表达显著增多(t=14.951、12.710，P均=0.000)；与MI组比较，MI+芪苈强心组、MI+卡托普利组大鼠心肌TLR4(t=7.536、7.704，P均=0.002)、NF-κB p65(t/P=6.103/0.004、5.398/ 0.006)蛋白表达显著减少；MI+芪苈强心组、MI+卡托普利组TLR4、NF-κB p65蛋白表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)，见图2。

2.3 各组大鼠心肌炎性因子表达比较 与假手术组比较，MI组大鼠心肌TNF-α、IL-1β表达量显著增多(t=19.272、15.140，P均=0.000)；与MI组比较，MI+芪苈强心组、MI+卡托普利组大鼠心肌TNF-α(t=6.660、6.710，P均=0.003)、IL-1β表达量显著减少(t/P=6.655/0.003、5.323/0.006)；MI+芪苈强心组、MI+卡托普利组TNF-α、IL-1β表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)，见图2。

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡比较 正常心肌细胞核TUNEL染色呈淡蓝色，细胞核大小、形态较为一致。

注：A.假手术组；B.MI组；C.MI+芪苈强心组；D.MI+卡托普利组

凋亡心肌细胞核TUNEL染色呈棕色或棕褐色,细胞核大小不一，核内染色质皱缩呈蓝色颗粒状位于核膜下，见图3；假手术组心肌组织中可见极少量凋亡细胞(4.37±0.49)%，MI组心肌细胞凋亡率(48.97±2.35)%，较假手术组显著升高(t=18.548，P=0.000)；与MI组比较，MI+芪苈强心组心肌细胞凋亡率(32.03±1.94) %显著降低(t=5.548，P=0.005)；MI+芪苈强心组与MI+卡托普利组心肌细胞凋亡率(33.57±1.71)%比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

心肌细胞凋亡、坏死及免疫炎性反应的过度激活是心肌梗死后心力衰竭的重要发病机制。因此，保护缺血心肌、抑制炎性反应对心肌梗死后心力衰竭的防治具有重要意义。芪苈强心胶囊是根据中医络病理论研制的中药复方制剂，具有益气温阳、活血通络、利水消肿之功效，对心肌梗死后心力衰竭具有较好疗效，但其具体药理机制仍有待阐明。本研究从免疫炎性反应角度探讨芪苈强心胶囊对心肌梗死后心肌的保护作用及机制。研究结果提示，芪苈强心胶囊可能通过TLR4/NF-κB信号通路减轻心肌梗死大鼠心肌免疫炎性反应和结构损伤。

心肌梗死后心肌缺血、缺氧导致心肌细胞结构、功能损伤。受损细胞释放的损伤相关分子模式可与Toll样受体、补体等模式识别受体结合，启动天然免疫应答，诱导炎性因子释放和炎性反应[6]。TNF-α、IL-1β等炎性因子在梗死区心肌表达增多，可诱导心肌细胞凋亡、坏死，促进心肌纤维化和心室重构[7-8]。有研究表明，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等炎性因子表达水平与心肌梗死患者的心功能、危险分层及预后密切相关[9]。芪苈强心胶囊能够降低慢性心力衰竭患者血清炎性因子表达，改善心脏功能[10]。然而，芪苈强心胶囊对梗死心肌局部炎性因子的表达是否具有调节作用，目前鲜有研究报道。本研究中，MI+芪苈强心组心肌TNF-α、IL-1β表达较MI组显著减少，心肌细胞凋亡及心肌结构损伤明显减轻，提示芪苈强心胶囊可能通过抑制心肌免疫炎性反应参与对缺血心肌的保护。

注：A.假手术组；B.MI组；C.MI+芪苈强心组；D.MI+卡托普利组

注：A.假手术组；B.MI组；C.MI+芪苈强心组；D.MI+卡托普利组

目前，芪苈强心胶囊抑制梗死心肌免疫炎性反应的具体机制仍不十分明确。Han等[11]研究发现，芪苈强心胶囊能够抑制TGF-β1/Smad3及NF-κB信号通路，减少心肌梗死大鼠心肌TNF-α、IL-6表达，减轻心肌纤维化和心室重构。Fu等[12]研究发现，芪苈强心胶囊较贝那普利更显著改善心肌梗死大鼠心力衰竭标志物水平，并增加心肌保护性蛋白血管生成素样4表达，降低炎性反应相关的脂蛋白和溶血磷脂酸水平，通过调节心肌免疫炎性反应过程改善心脏功能。另外，芪苈强心胶囊的多个组方成分如人参、丹参、葶苈子、黄芪等均被证实可通过多种机制调节心肌炎性因子表达[13-15]。因此推测，芪苈强心胶囊抑制心肌免疫炎性反应的机制可能与其对复杂炎性反应网络的多方面调控有关。

TLR4/NF-κB是经典的炎性反应信号转导通路，其激活后可促进下游炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等表达，从而诱导免疫炎性反应和靶细胞凋亡、坏死[16]。TLR4在心肌组织中高表达，TLR4及其相关信号转导通路已被许多研究证实参与心肌梗死后心力衰竭的发病和进展[17-18]。芪苈强心胶囊能否作用于TLR4/NF-κB信号通路并减轻其介导的心脏免疫炎性反应和心肌损伤，目前尚无报道。在本研究中，MI组大鼠心肌TLR4、NF-κB表达显著增多，而MI+芪苈强心组TLR4、NF-κB表达较MI组显著减少，提示芪苈强心胶囊可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻心脏免疫炎性反应和心肌细胞凋亡，从而对缺血心肌发挥保护作用。

ACEI/ARB类药物是预防心肌梗死后心室重构和心力衰竭的常用药物。除抑制肾素—血管紧张素—醛固酮系统外，ACEI/ARB类药物还具有抗炎、抗氧化、血管内皮保护、延缓动脉粥样硬化进展、调节血管纤维蛋白溶解平衡、抗血小板凝集等多重心血管保护作用。本研究比较了芪苈强心胶囊与卡托普利在调节心肌梗死大鼠心肌炎性反应和损伤中的作用。结果发现，MI+芪苈强心组与MI+卡托普利组在TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表达方面无显著差异，提示芪苈强心胶囊对梗死心肌免疫炎性反应的调节作用可能不劣于卡托普利，但仍有待临床研究证实。

综上所述，芪苈强心胶囊通过抑制免疫炎性反应，减轻心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和心肌结构损伤；芪苈强心胶囊的抗炎、抗凋亡作用可能与其抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

马小林：课题设计，统计分析，论文撰写；黄政：课题设计，参与撰写；方存明：选择课题，论文修改、审核；胡学俊、刘冰、伍超、龚天奎、丁文龙：研究实施，数据获取