2型糖尿病相关静脉桥内膜增生的动物模型建立与机制分析

李波，刘长城，李海明，戴龙圣，顾承雄

冠心病三支病变合并2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)首选冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting, CABG)治疗，大隐静脉桥是CABG应用最多的桥血管材料[1-2]。然而，研究显示T2DM显著增加CABG术后静脉桥闭塞风险[3]。目前研究已证实糖尿病微血管病变(视网膜病、肾病和神经病变)与高血糖、胰岛素抵抗和高胰岛素血症密切相关[4]，但是T2DM相关的桥血管病变机制仍未完全阐明。尽管积极应用降糖策略维持正常的血糖水平，T2DM患者CABG术后5年和10年生存率仍显著低于无T2DM患者，并且死亡风险增加2倍[5]。所以，高血糖并不是T2DM患者心血管病风险增加的惟一决定因素。因此，建立可靠的动物模型，探究T2DM导致桥血管病变的病理生理异常机制意义重大。本研究确立了一种可靠、重复性强的T2DM相关静脉桥内膜增生的动物模型建立方法，初步探讨了T2DM导致静脉桥病变的病理生理机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与建模 2019年9—11月于北京安贞医院动物实验室进行实验。新西兰雄性大白兔36只，体质量2.5～3.5 kg(购买于北京芳缘养殖厂)。整个研究过程均普通喂养。将实验兔随机数字表法分为2组：T2DM组24只，对照组12只。

T2DM模型建立具体方法：将链脲佐菌素(Sigma公司，美国)溶解于4℃冰箱预冷pH 4.2的0.1 mol/L柠檬酸钠—柠檬酸缓存液中，配成25 mg/ml的链脲佐菌素溶液(每次现配现用，配制30 min内用完)。T2DM组模型兔禁食12 h, 用3%戊巴比妥钠盐溶液(1 ml/kg)经耳缘静脉缓慢注射进行麻醉后，将链脲佐菌素溶液按50 mg/kg剂量经耳缘静脉注射，3 d和6 d后分别再次注射等剂量溶液，之后每2周测量一次空腹血糖，连续2次血糖>11.1 mmol/L视为建模成功[6]。而对照组只注射等体积的柠檬酸钠—柠檬酸缓存液。

1.2 颈动脉旁路移植术方法 诱发T2DM 4周后，2组实验兔均行颈动脉旁路移植术，术前6 h禁食水。麻醉同前，用“No-touch”法游离一侧颈外静脉。500 U/kg普通肝素全身肝素化后，用血管吻合轮(新华手术器械有限公司，山东淄博)将3 cm长颈外静脉离断后端—端吻合于原位颈动脉之间，建立兔颈动脉旁路移植模型，详细方法见参考文献[7]。

1.3 观察指标与方法 移植4周后，获取静脉桥，同时在对照组未静脉移植侧获取正常颈外静脉，作为空白对照组。(1)静脉组织结构观察：所有静脉组织进行HE和Masson染色，观察各组静脉桥组织结构；(2)静脉桥组织细胞因子检测：采用免疫组化染色和Western-blot法检测白介素6 (IL-6)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)蛋白表达，所用抗体分别为抗IL-6抗体 ab9324、抗VCAM-1抗体ab98954(Abcam,UK)。

2 结 果

2.1 造模情况 T2DM组中24只兔有20只成功诱发T2DM，3只给药后饲养期间死亡，1只给药后血糖值未达诊断标准；颈动脉旁路移植后，其中1只麻醉意外死亡，1只移植后2周死亡，最终18只静脉桥合并T2DM的模型兔成功存活4周，而对照组12只均成功存活4周。

2.2 2组静脉组织结构比较 移植4周后，T2DM组静脉桥病理重构程度显著高于对照组。HE染色显示T2DM组静脉桥的炎性细胞浸润显著增多，Masson染色示T2DM组血管平滑肌层结构紊乱，且内膜层增厚比对照组显著(图1)；T2DM组静脉桥内膜增厚显著大于对照组[(137.8±19.2) μm vs.(116.2±15.5) μm,t=3.249,P=0.003)]。

2.3 静脉桥组织细胞因子比较 免疫组化染色显示T2DM组静脉桥的IL-6和VCAM-1染色显著多于对照组(图2)，而且Western-blot蛋白检测也显示T2DM组静脉桥IL-6和VCAM-1蛋白表达量显著高于对照组(IL-6：12.5±2.2vs.7.8±1.4,t=6.549,P<0.001;VCAM-1：48.3±7.9vs.22.1±5.6,t=9.921,P<0.001)，见图3。

图3 2组IL-6、VCAM-1蛋白电泳结果

3 讨 论

建立可靠的T2DM合并静脉桥内膜增生的动物模型对研究T2DM相关的桥血管病变机制至关重要。目前，国内最常用小鼠诱发T2DM模型，然而小鼠周围血管细小，建立动脉旁路移植模型存在技术困难，可重复性较差，所以本研究选用兔诱发T2DM并行颈动脉旁路移植。链脲佐菌素和四氧嘧啶是国内外最常用的化学损伤诱导DM的药物。与四氧嘧啶比较，链脲佐菌素对肝肾功能损伤小，建模容易存活，对胰岛β细胞具有高度选择性。上述两种药物建立兔DM模型经静脉注射给药剂量范围为40～150 mg/kg，二者建模成功率无显著差别[6]。所以本研究选用链脲佐菌素50 mg/kg，共给药3次，每次间隔3 d，诱发T2DM。研究表明，一次性大剂量给药，直接导致胰岛β细胞广泛坏死，容易诱发T1DM；而多次小剂量给药，只破坏部分胰岛β细胞，并造成周围组织对胰岛素不敏感，容易诱发T2DM[8]。 对于使用颈外静脉行颈动脉旁路移植，笔者选择血管吻合轮，而非缝线直接缝合。吻合轮内径固定(1.5 mm)，无缝线吻合相关吻合口狭窄风险，容易操作，也可保障旁路移植手术的安全性和一致性。本研究结果证实，建立兔T2DM相关静脉桥再狭窄模型的方法效果可靠，可重复性强。

图1 3组兔颈静脉桥HE和Masson染色结果(×100)

注：A.T2DM组血管IL-6表达；B.T2DM组VCAM-1表达；C.对照组血管IL-6表达；D.对照组VCAM-1表达

以往研究表明，控制血糖本身不能显著降低心血管事件风险[9-12]。本研究中模型动物正常喂养，未控制血糖。移植4周后，静脉桥病理观察发现，T2DM显著增加血管壁中炎性细胞浸润，这表明T2DM加重静脉桥炎性反应，进而促进静脉桥内膜增生。该结果与Zhang 等[13]研究猪模型发现糖尿病在冠状动脉中诱发炎性反应的结果相一致。

笔者进一步分析了T2DM相关静脉桥病变的分子机制。T2DM可促进致炎性细胞因子IL-6和VCAM-1在静脉桥中的大量表达。大量研究证据表明，T2DM可损伤血管内皮细胞(endothelial cell, EC)和平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)功能[14-16]。VCAM-1是细胞黏附分子超家族成员，在血管损伤刺激下主要由EC和SMC大量分泌，并黏附白细胞，促进血管炎性反应[17-18]。动物模型研究表明，应用单克隆抗体阻断VCAM-1生物活性，可显著缓解血管内膜增生[19-20]。

IL-6是重要的致炎因子，不仅可促进细胞黏附分子合成，而且可诱导SMC增殖并分泌基质金属蛋白酶，后者可分解细胞外基质，促进SMC向内膜下迁移，最终导致内膜增生[21]。研究表明T2DM患者血浆IL-6水平较无T2DM患者高2～3倍[22]。 Xiang等[23]发现IL-6高表达与CABG术后静脉桥病变密切相关。当前研究表明，IL-6可通过JAK/STAT、ERK1/2和PI3K等多种信号分子通路调控细胞病理生理活动[24]。

尽管本研究结果表明，T2DM可通过调控致炎因子IL-6和VCAM-1的表达影响静脉桥病变，但是T2DM通过何种信号分子通路机制发挥作用，仍然需要使用T2DM相关静脉桥病变模型进行深入的基础研究来阐明，这对寻找新的干预靶点意义重大。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

李波、刘长城：论文撰写，论文修改；李海明：数据分析；戴龙圣：研究实施；顾承雄：研究设计，论文审核