6例成人t(4；11)(q21；q23)急性淋巴细胞白血病的遗传学研究

刘雯，米瑞华，胡杰英

(郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院 a.中心实验室；b.血液科，河南 郑州 450008)

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一种常见的恶性血液病，以骨髓和淋巴组织中不成熟淋巴细胞的异常增殖和聚集为特点，生物学特征多样，临床异质性很大[1]。ALL的特异性染色体重排与白血病细胞的免疫学亚型相关。染色体易位t(4；11)(q21；q23)见于2%～6%的ALL，免疫学分型方法显示前或早前急性B淋巴细胞白血病表型，分子学检测揭示该易位导致原来位于4号染色体长臂2区1带(q21)的AF4基因和位于11号染色体长臂2区3带(q23)的混合谱系白血病基因(mixed lineage leukemia，MLL)并置在一起，形成了MLL-AF4融合基因[2]。在MLL-AF4融合基因显示阳性的ALL患者中，50%是不满6个月的婴儿，稍大一点的婴儿占10%～20%，成人占7%[2]。婴幼儿中完全缓解率(complete remission，CR)为88%，但中位总体生存时间(median overall survival，OS)仅为10个月。在成人患者中，CR为88%，但OS也仅为7个月[2]。多数患者在临床治疗中会对现有常规化疗耐药，进行造血干细胞移植、生物治疗、联合抗反转录病毒治疗(combined antiretroviral therapy，cART)后也容易复发，是一个独立的预后不良因素，其发病机制不明，暂缺乏有效的靶向治疗措施。本研究对6例成人t(4；11)(q21；q23)急性淋巴细胞白血病应用RT-RCR检测融合基因，并通过荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)检测加以验证，对临床和实验室特点亦进行了总结，以提高对成年伴t(4；11)(q21；q23)急性淋巴细胞白血病的认识。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2014年4月至2020年4月郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院染色体检测标本共9 662例，其中初诊ALL 323例，占3.34%。伴t(4；11)(q21；q23)急性淋巴细胞白血病7例，占ALL的2.17%，女4例，男3例，1例为儿童，6例为成人，成人中位发病年龄40岁。6例患者均接受血常规、细胞形态学、细胞遗传学、MLL-AF4融合基因检测、免疫分型检测、FISH检测。

1.2 染色体核型分析方法染色体标本采用R显带法分析，取患者骨髓标本，每份标本分别用小牛血清和1640培养液常规短期培养，秋水仙碱阻滞细胞停留在细胞分裂中期，使用氯化钾低渗，经甲醇/冰乙酸固定液(甲醇和乙酸体积比为3∶1)固定后制片，Earle’s显带液显带，Giemsa染色液染色。运用德国ZISS公司生产的染色体全自动扫描分析系统扫描采集中期细胞图像，核型异常识别和描述参照《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2016)》。

1.3 MLL-AF4检测方法对MLL-AF4基因采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription，RT-PCR)检测，抽取患者外周血2 mL，提取总RNA，以ABL基因为内参基因。

1.4 免疫分型应用流式细胞仪间接免疫荧光法和一组单抗检测肿瘤细胞的表面抗原。判断标准为胞质抗原≥10%为阳性，细胞膜表面抗原≥20%为阳性。

1.5 FISH检测MLL基因重排检测探针购自美国雅培公司，-20 ℃保存备用。MLL双色断裂重排探针是用于检测11号染色体2区3带MLL基因的易位与重排。标本用探针标记后在Olympus BX51荧光显微镜的DAPI/FITC/TRITC三色滤光镜下观察细胞荧光杂交信号：两黄色荧光信号者为MLL断裂重排阴性细胞，一红一绿一黄色荧光信号者为MLL基因断裂重排阳性细胞，每例至少分析200个间期细胞。计算阳性细胞的比率。应用VideoTest FISH 2.1图像分析系统进行图像采集并保存。

2 结果

2.1 临床和血液学特点初诊时外周血中位白细胞计数为268(2.16～638)×109L-1，中位血小板计数为85(15～148)×109L-1，中位血红蛋白53.5(36～76)g·L-1，中位骨髓原始、幼稚淋巴细胞百分比66.8%(37.5%～91%)，中位总体生存期10(6～41)个月。

2.2 染色体核型分析6例患者的染色体核型结果见表1。例1、2、3、6核型为单纯t(4；11)(q21；q23)(图1)，例4同时合并衍生4号染色体(der4)，例5合并衍生10号染色体异常(der10)。

表1 6例伴t(4；11)急淋患者细胞遗传学、分子生物学及治疗反应

图1 核型异常的骨髓样本的细胞遗传学分析(箭头示易位染色体)

2.3 RT-PCR对6例患者进行RT-PCR检测，均为MLL-AF4融合基因阳性。

2.4 流式免疫分型以异常幼稚B淋巴细胞为主，例1表达CD19、CD22、CD123、HLA-DR、cCD9a、CTDT，弱表达CD38、CD15。例2表达CD45、CD19、CD38、CD123、CD10-、CD34-、CD20-。例3表达CD38、HLR-DR、CD19、CD15、CD22、cCD79。例4表达CD19、CD38、CD58，部分表达CD22、CD123、cCD79a。例5表达CD19、CD38、HLA-DR、cCD22、cTDT、cCD79a，部分表达CD2，弱表达CD15。例6异常淋系表型，表达CD19、CD38、CD81、CD200、CD43、cCD79a，少部分表达CD10。

2.5 FISH检测6例患者均经FISH检测证实为MLL基因分离重排阳性。

3 讨论

本研究中6例成人t(4；11)(q21；q23)染色体易位的患者临床诊断均为急性淋巴细胞白血病，研究表明该易位产生MLL-AF4融合基因。MLL-AF4融合基因又称为组蛋白赖氨酸[K]-甲基转移酶2A基因(KMT2A-AFF1基因)，KMT2A-AFF1融合蛋白参与造血干细胞的自我更新分化，高表达引起不良预后[3]。t(4；11)(q21；q23)染色体易位与急性淋巴细胞白血病高度相关，欧洲1lq23协作组曾报道过183例伴t(4；11)的急性白血病，在这些病例中绝大部分(94.5%)为ALL，证实了t(4；11)和ALL高度相关[4]。

t(4；11)(q21；q23)染色体易位的ALL临床表现常伴肝脾大、淋巴结浸润；本组患者染色体核型分析有附加异常2例，无附加异常单纯4例，11易位的4例，免疫表型以异常B淋巴细胞为主，6例患者均表现为MLL基因重排，这种重排会导致极差的急性淋巴细胞白血病预后，疾病恶性程度很高，5例死亡，1例发病8个月，目前仍在治疗中。虽然这种类型白血病中成人占比较低，但如何提高这类疾病的预后仍是需要去探索的问题。由于患者对化疗的不敏感以及肿瘤较高的恶性程度，除了针对性解决外周血白细胞升高、血小板降低、贫血等临床症状，预防中枢神经系统白血病的发生，异基因造血干细胞移植也是这类患者获得长期无病生存、重建免疫功能及造血功能的重要治疗策略。但一些患者由于疾病进展太快，无法找到适合移植的供者，同时也面临着移植费用较高及移植后存在排异反应风险的难题。

对比6例患者的免疫表型发现，均表达CD19特异性蛋白，其中有1例患者接受了嵌合抗原受体基因修饰靶向B细胞恶性肿瘤抗原CD19(CART-19)的免疫细胞治疗临床试验，但并没有取得很好的疗效，原因可能在于复发后疾病进展比较迅速，如果在疾病早期尽早干预可能会取得更好的效果，对于效果的验证需要更多的临床数据来支撑。国内很多实验室都成功建立了CART-19细胞的体外扩增体系，体外杀伤实验确定CART-19细胞能特异杀伤CD19阳性的肿瘤细胞[5]。但只有在解决了安全性、有效性等问题后，才能广泛应用于临床治疗。

最新的一项研究是MLL-AF4通过激活关键靶基因促进白血病的发生，一个关键的MLL-AF4靶基因是PROM1，它编码了CD133[6]；CD133是一种5次跨膜糖蛋白，它代表了一种潜在的泛癌靶点，存在于多种癌症干细胞中；异常的PROM1/CD133表达对于白血病细胞生长是必需的，由MLL-AF4基因的直接结合介导；上述结果提供了第1个详细的分析方案，解释了CD133在巨噬细胞白血病细胞中的表达。PROM1/CD133作为潜在治疗靶标最吸引人的特征之一来自于对该基因是MLL-AF4调节的直接靶标的认识[7]，这表明在t(4；11)白血病中PROM1/CD133的表达与融合蛋白本身的活性紧密相关。了解这些机制可能是将来在这类白血病中开发PROM1/CD133导向的靶向治疗的关键。