2株鸡细小病毒全基因组序列测定与分析

高倩文，王君娜，张宇名，尹燕博，徐守振

(青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109)

鸡细小病毒(Chicken parvovirus，ChPV)是一种无囊膜的单链DNA病毒，基因组长约为5 000 kb，包括3个开放阅读框(ORF)。ORF1编码非结构蛋白(NS)，ORF2编码衣壳结构蛋白(VP1和VP2)，而位于ORF1和ORF2之间的ORF3编码假定蛋白(NP)，其功能目前尚不清楚[1]。ChPV是引起鸡肠道疾病重要的病原体之一，能引起禽肠炎综合征和发育障碍与矮小综合征等疾病。临床特征表现为腹泻、精神沉郁、发育迟缓、体重增加减慢、上市时间增加 ； 更严重的能导致免疫功能障碍和死亡率增加[2-3]。已有研究表明,该病在鸡群中普遍存在，主要侵害雏鸡，以商品肉鸡的感染率较高，种鸡和蛋鸡次之[4]。迄今为止，已有39株完整的ChPV基因组序列在GenBank中提交，1株来自匈牙利[5]，4株来自美国[6]，5株来自韩国[7]，29株来自中国广州[8]。目前，虽然致病毒株仍未确定，但是ChPV在鸡群中的流行率却仍在增加。本研究将测序的2株ChPV完整的基因组编码序列与来自不同地区参考株的基因组序列进行同源性和遗传进化分析，为ChPV基因组来源和遗传进化特征提供参考，有助于更好地防控ChPV引起的有关疾病。

1 材料与方法

1.1 病料 本实验室检测的ChPV阳性病料分别来自山东潍坊和河南濮阳某养鸡场，病鸡表现腹泻、体重减轻、发育迟缓等临床症状。

1.2 主要试剂和仪器PremixTaqTM、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、DL-2 000 DNA Marker,均购自宝生物工程(大连)有限公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,购自康为世纪生物技术有限公司。高速离心机Pico17型,购自ThermoFisher公司；LifeTouch基因扩增仪TC-96/G/H(b)型，购自杭州博日科技有限公司；电泳仪JY600E型、凝胶成像仪JY04S-3C型，均购自北京君意东方电泳设备有限公司；恒温培养箱XT5116-IN70型，购自杭州雪中炭恒温技术有限公司。

1.3 引物 ChPV检测引物[9]和基因组测序引物[7]，均由睿博兴科生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 ChPV检测引物和基因组测序引物Table 1 Detection primers and genome sequencing primers for ChPV

1.4 临床病料检测 根据TIANGEN病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，从山东潍坊和河南濮阳某养鸡场送检的病料中提取病毒DNA，使用ChPV检测引物PVF1和PVR1对ChPV非结构基因(NS)保守区域的561 bp区段进行PCR扩增，将电泳鉴定结果为阳性的PCR产物送至睿博兴科生物技术有限公司测序。

1.5 基因组提取 根据TIANGEN病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，从测序结果ChPV阳性的病料中提取病毒的基因组，用40 μL RNase-Free H2O洗脱后测DNA的浓度，于-20 ℃保存备用。

1.6 基因组分段PCR扩增 以1.5步骤所得DNA为模板进行ChPV基因组各片段的扩增。PCR反应体系：DNA 1 μg，PremixTaqTM25 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，ddH2O补足50 μL。分别用引物ChPV-A1/A2和ChPV-B1/B2扩增片段A和B，反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。引物ChPV-C1/C2和ChPV-D1/D2扩增片段C和D，反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。引物ChPV-E1/E2、ChPV-F1/F2和ChPV-G1/G2扩增片段E、F和G，反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s， 72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。

1.7 基因组各片段克隆 PCR产物分别经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对各目的片段进行纯化回收，回收产物于-20 ℃保存备用。将PCR纯化回收产物分别与pMDTM18-T Vector进行16 ℃连接30 min。连接体系：PCR产物4 μL，pMDTM18-T Vector 1 μL，Solution Ⅰ5 μL。将连接产物转化至XL1-Blue感受态细胞中，挑单菌落摇菌，应用步骤1.6中的反应体系及反应程序进行菌液PCR验证，将电泳鉴定结果为阳性的菌液送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序。

1.8 基因组序列同源性及遗传进化分析 应用DNAMAN软件将测得的7段基因序列进行拼接，组成完整的基因组序列。应用DNASTAR软件和MEGA软件分别对ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的基因组、NS基因、VP基因的核苷酸序列及其氨基酸序列与GenBank登录的具有代表性的39株ChPV参考株以及2株美国火鸡细小病毒(TuPV)参考株基因组进行基因特征和同源性分析。应用MEGA 5.02软件Neighbor-Joining方法将ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株与GenBank登录的参考株构建基因组的遗传进化树，分析ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株基因组的遗传进化关系。应用SimPlot 3.5.1(http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot)分析分离株的重组情况。

1.9 VP2蛋白三级结构预测 利用Phyre 2(Protein Homology/AnalogyRecognition Engine2)(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/)预测ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株VP2蛋白的三级结构，应用PYMOL Viewer(http://www.pymol.org)分析预测的三级结构。

2 结果

2.1 临床病料的检测 应用PVF1和PVR1检测引物分别从山东潍坊送检的肠、法氏囊病料和河南濮阳送检的腺胃、肝、肠病料中PCR扩增出片段长度为561 bp的目的片段，如图1和图2所示。测序结果BLAST比对分析确定送检的2份病料均为ChPV阳性病料，分别将其命名为ChPV-SDWF和ChPV-HNPY。

图1 山东潍坊临床病料PCR检测结果Fig.1 PCR test results of clinical material from Weifang districtM：DL-2 000 DNA marker； 1～8：心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、法氏囊； 9：阴性对照M:DL-2 000 DNA marker; 1～8:Heart, liver, spleen, lung, kidney,intestine, brain, bursa of fabricius; 9:Negative control

图2 河南濮阳临床病料PCR检测结果Fig.2 PCR test results of clinical material from Puyang districtM：DL-2 000 DNA marker； 1～3：腺胃、肝、肠； 4：阴性对照M:DL-2 000 DNA marker; 1～3:Glandular stomach,liver, intestine; 4:Negative control

2.2 基因组各片段的PCR扩增 以ChPV阳性病料提取的DNA为模板，分段扩增出302 bp、1 559 bp、1 360 bp、 569 bp、895 bp、1 448 bp、333 bp的ChPV基因组片段，与预期片段大小一致，如图3所示。

图3 ChPV基因组各片段PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification results of each fragment of ChPV genomeM：DL-2 000 DNA marker； 1～7：片段A、片段B、片段C、片段D、片段E、片段F、片段G； 8：阴性对照M:DL-2 000 DNA marker; 1～7:Fragment A, fragment B,fragment C, fragment D, fragment E, fragment F,fragment G; 8:Negative control

2.3 基因组序列结构分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株基因组全长编码核苷酸序列均为4 615 bp， 包含3个开放阅读框。ORF1编码非结构蛋白NS1，ORF2编码次要和主要衣壳结构蛋白VP1和VP2，ORF3编码假定蛋白NP1。NS1(1～2 085 nt)从ATG开始到TAG结束，共2 085 bp，编码694 aa。

NP1(2 286～2 591 nt)长为306 bp，编码101aa；NS1和NP1之间存在201 nt非编码区。VP1(2 588～4 615 nt) 从ATG到TAA共含有2 028 bp，编码675 aa；VP2(3 005～4 615 nt)从VP1中间开始编码，与VP1共用1个终止密码子TAA，全长1 611 bp，编码536 aa；在3 197～3 199nt可能存在VP3的起始密码子ATG。

2.4 基因组核苷酸序列同源性与遗传进化分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株2个分离株间核苷酸同源性为96.9%，ChPV-SDWF株和ChPV-SDWF株与美国TuPV参考株TuPV-260同源性分别为95.7%和95.4%，与匈牙利ChPV参考株ChPV-ABU-P1同源性分别为95.1%和94.9%，与4株美国ChPV参考株同源性分别为85.4%～93.0%、85.1%～93.6%，与5株韩国参考株同源性分别为88.3%～92.2%、87.6%～92.1%，与29株中国广西参考株的同源性分别为81.6%～94.7%、81.5%～95.4%。基于核苷酸序列的基因组遗传进化分析表明，ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株位于同一个小的分支，与匈牙利ChPV参考株ChPV-ABU-P1和美国TuPV参考株TuPV-260位于同一个大的分支，ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株亲缘关系最近，二者与TuPV-260株亲缘关系较近，其次是ChPV-ABU-P1株(图4)。用Z检验进行基因选择分析发现2个分离株的全基因组都进行了纯化选择(负选择)。SimPlot分析表明，ChPV-SDWF株(见封三彩版图5A)和ChPV-HNPY株(见封三彩版图5B)基因组核苷酸序列没有出现重组信号，分离株与参考株间5′端NS1基因同源性高，3′端的VP1基因和VP2基因同源性低，VP2基因同源性最低。

图4 基因组遗传进化树Fig.4 Phylogenetic tree constructed on genomic sequences

图5 分离株基因组序列Simplot分析结果Fig.5 Simplot analysis based on full-length nucleotide sequencesA:ChPV-SDWF株基因组； B:ChPV-HNPY株基因组A:Genome of ChPV-SDWF; B:Genome of ChPV-HNPY

2.5NS1基因序列 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的NS1基因具有高度同源性，其核苷酸和氨基酸同源性分别为98.0%和99.0%。ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株与国内外ChPV参考株NS1基因核苷酸分别为88.6%～97.2%、88.4%～97.5%，氨基酸同源性分别为92.5%～99.1%、92.4%～99.1%；与TuPV参考株NS1基因核苷酸同源性分别为88.5%～97.7%、88.3%～97.1%，氨基酸同源性分别为89.8%～98.9%、90.1%～98.1%。ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的NS1基因的392～399 aa位和436～437 aa位都存在保守的P-loop基序(GPANTGKT)和NTP结合基序(EE)。

2.6VP1基因序列分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株之间的VP1核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%和98.4%。2个分离株与ChPV参考株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为73.4%～95.7%、79.6%～99.0%；与TuPV参考株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为73.9%～94.8%、79.5%～99.0%。在ChPV-SDWF株VP1基因的164～170 aa位和ChPV-HNPY株VP1基因的163～170 aa位存在富含甘氨酸(G)基序，但ChPV-SDWF株比ChPV-HNPY株少1个G。

2.7VP2基因序列分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的VP2核苷酸和氨基酸同源性分别为94.4%和98.7%。2个分离株与ChPV参考株VP2基因核苷酸和氨基酸同源性分别为71.7%～95.0%和78.8%～99.4%；与TuPV参考株VP2基因核苷酸和氨基酸同源性分别为72.8%～94.1%和79.3%～99.4%。ChPV-SDWF株VP2基因的134～151 aa位存在五重圆筒基序(LQVIQKTVTDSGTQYSND)，在152 aa位存在1个亮氨酸(L)。

2.8 VP2蛋白三级结构预测结果 从预测得到的ChPV-SDWF株(见封三彩版图6A)和ChPV-HNPY株(见封三彩版图6B)VP2蛋白3D结构模型可以看出，VP2含有由8条反向平行的β折叠围成的桶，表面存在4个Loop，其中Loop3和Loop4变异最大。

图6 VP2蛋白的三级结构模型Fig.6 Tertiary structure model of VP2 proteinA:ChPV-SDWF株VP2蛋白； B:ChPV-HNPY株VP2蛋白A:VP2 protein of ChPV-SDWF; B:VP2 protein of ChPV-HNPY

3 讨论

ChPV是引起鸡肠道疾病的重要病原体之一，能导致家禽出现腹泻、体重减轻等症状。本研究从山东潍坊送检病死鸡的法氏囊和河南濮阳送检病死鸡的腺胃、肠道中成功检测出ChPV，通过PCR扩增出2株完整的基因组序列，在ChPV基因组各片段的PCR扩增过程中，通过对退火温度进行优化，最终确定片段1、2的最佳退火温度为55 ℃，片段3、4的最佳退火温度为60 ℃，片段5、6、7的最佳退火温度为58 ℃。

对来自不同地域的毒株进行基因组序列同源性和遗传进化分析发现，ChPV-SDWF株与ChPV-HNPY株核苷酸同源性最高，亲缘关系最近，其次与美国TuPV参考株TuPV-260和匈牙利ChPV参考株ChPV-ABU-P1核苷酸同源性较高，亲缘关系较近。通过对分离株与参考株的NS1基因、VP1基因和VP2基因核苷酸和氨基酸的同源性分析发现，NS1基因较VP1基因和VP2基因具有较高的保守性，其次是VP1和VP2基因。ChPV-SDWF株与ChPV-HNPY株与美国TuPV参考株TuPV-260具有较高的同源性和较近的亲缘关系，说明它们在某个时间从一个共同的祖先分化开来[5]，也说明了不同毒株同源性的高低以及亲缘关系的远近与不同毒株所处的地域没有直接的关联。基于ChPVVP1基因构建的遗传进化树同基于全基因组构建的遗传进化树的相似性好于基于NS1和VP2构建的遗传进化树(数据未提供)，据此可推测可用VP1基因来代替全基因组构建遗传进化树。VP2蛋白的三级结构表明在蛋白外表面有4个Loop，内部有1个由8条反向平行的β折叠形成的桶，与ChPV ABU-P1基因组具有类似的结构[12]。

本研究提供了2株ChPV完整的基因组序列，并对来自不同地域的毒株进行基因组序列同源性和遗传进化分析。鉴于鸡群感染ChPV造成的经济损失，有必要对我国鸡群中ChPV的地理分布进行广泛的流行病学研究。本研究可为ChPV诊断和流行病学研究提供参考。