代谢工程优化大肠杆菌高效合成L-苯丙氨酸

门佳轩，熊 博，郝亚男，李 旋，刘益宁，谢希贤

（天津科技大学生物工程学院，代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457）

L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-Phe）是一种重要的药品和食品化学品的中间体，参与合成动物体内重要的神经递质与激素，在医药、食品领域均有广泛应用[1]。作为一种抗癌药物的载体，L-Phe可将抗癌药物导入肿瘤位置，在抑制肿瘤增长的同时又可大幅降低药物毒副作用。此外，L-Phe也是低热量甜味剂阿斯巴甜的主要合成原料。近年来，随着肿瘤药物及甜味剂阿斯巴甜的市场需求不断增加，L-Phe供应也在逐年增长[2]，这对L-Phe的工业生产提出了更高的要求。此前，L-Phe生产方法主要分为化学合成法、酶法以及微生物发酵法。近年来，由于化学合成法及酶法生产成本高昂、材料来源有限及环境污染严重等问题，L-Phe主要生产方法已发展为相对经济环保的微生物发酵法[3]。微生物发酵法中产能主要取决于工程菌株的性能，高效的工程菌株可有效提高综合产能并节约生产成本。然而，现有工程菌株普遍存在生产效率低下以及携带质粒等问题，导致生产成本较高，限制了规模化工业应用。因此，构建1 株高效、无质粒的L-Phe工程菌株意义重大。

随着合成生物学及系统代谢工程等技术手段的发展，L-Phe的生物合成及代谢调控在大肠杆菌中得到广泛研究。L-Phe合成途径由中心代谢途径、莽草酸途径及分支途径3 部分组成，常规L-Phe生产菌株构建策略也主要集中在这3 个方面[4]。首先是解除双功能酶PheA和3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate，DAHP）合成酶AroG的反馈抑制并增强其表达。Backman等[5]在1 株酪氨酸缺陷菌株中通过质粒过表达了解除反馈抑制的pheAfbr（抗反馈抑制）和aroFfbr基因，发酵36 h后，产量达50 g/L。其次是增强前体物赤藓糖-4-磷酸（erythrose-4-phosphate，E4P）与磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）的供应。由于PEP分流十分明显，大部分参与到磷酸葡萄糖转移酶（glucose phosphotransferase，PTS）系统的摄糖作用中[6]，因此多数研究都是利用其他酶代替PTS系统进行糖的摄取[7-8]。而这种策略在节省大量PEP的同时会严重影响菌体生长，因此不适于工程菌株的构建。最后则是强化莽草酸途径部分基因。Liu Yongfei等[9]在1 株L-酪氨酸缺陷型大肠杆菌中通过质粒过表达了去反馈抑制的关键酶及3-脱氢奎宁酸脱水酶基因aroD，同时过表达大肠杆菌自身的半乳糖透性酶基因galP及葡萄糖激酶基因glk以代替失活的PTS系统，利用该菌株发酵52 h后，L-Phe产量达72.9 g/L，生产强度达到1.4 g/（L·h），是目前为止报道的L-Phe最高产量。

上述菌株的改造策略虽指导了后续L-Phe菌株的构建，但与现有工程菌株一样，由于上述菌株为缺陷型菌株且携带质粒等问题，发酵过程中需要添加抗生素和缺陷型氨基酸以保证菌株稳定生产，这些弊端无疑会增加工业生产的成本，降低产品在市场上的竞争力。此外，常规改造策略多是对双功能酶PheA、DAHP合成酶、前体物供应等关键节点进行改造，少有全面系统对大肠杆菌中L-Phe代谢网络进行优化，这就可能导致代谢流至某一步反应时发生阻塞，积累毒副产物，影响菌体生产。针对上述问题，本研究从大肠杆菌基因组水平出发，通过代谢工程技术手段，分模块依次对L-Phe分支途径、莽草酸途径以及中心代谢通路进行系统全面的优化。首先，通过强化L-Phe合成支路获得1 株能够初步积累L-Phe的菌株；在此基础上，对莽草酸途径各基因的表达强度进行优化以确定最适表达量；最后，通过增强中心代谢途径中前体物的供应，获得1 株稳定高产、无质粒的非缺陷型大肠杆菌L-Phe生产菌株（图1）。

图1 大肠杆菌L-Phe合成代谢路径Fig. 1 Biosynthetic pathways of L-phenylalanine in Escherichia coli

1 材料与方法

1.1 培养基

LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。

2×YT培养基：蛋白胨1.6 g/100 mL，酵母粉1 g/100 mL，NaCl 0.5 g/100 mL。

斜面培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖5 g/L，琼脂20 g/L。

种子培养基：酵母粉10 g/L，(NH4)2SO44 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，柠檬酸钠2 g/L，NaCl 1 g/L，微量元素混合液1 mL/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L，CaCl2·2H2O 0.015 g/L。

发酵培养基：酵母粉5 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，柠檬酸钠2 g/L，NaCl 1 g/L，微量元素混合液1.5 mL/L，FeSO4·7H2O 30 mg/L，CaCl2·2H2O 0.015 g/L。

微量元素混合液：Na2MoO4·2H2O 2.5 g/L，AlCl3·6H2O 2.5 g/L，NiSO4·6H2O 2.5 g/L，CoCl2·6H2O 1.75 g/L，CaCl2·2 H2O 10 g/L，ZnSO4·7 H2O 0.5 g/L，CuCl2·2 H2O 0.25 g/L，H3BO30.125 g/L。

1.2 仪器与设备

5 L自动控制发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；UV 200II紫外-可见波长检测器 美国Laballiance设备公司；1200高效液相色谱仪 美国Agilent公司；SBA-40C生物传感仪 山东省科学院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 工程菌株的构建

利用规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技术对菌株基因进行改造，完成工程菌的构建[10]。CRISPR/Cas9系统包括pGRB和pREDCas9两个质粒。pREDCas9质粒主要由RED重组酶、Cas9蛋白及pGRB质粒消除系统组成，含奇霉素抗性（质量浓度100 mg/L、32 ℃培养）。pGRB质粒主要由启动子、gRNA-Cas9蛋白结合区域和终止子组成，含氨苄青霉素抗性（质量浓度100 mg/L、37 ℃培养）。pGRB质粒能够转录出相应的gRNA与Cas9蛋白形成复合物并识别到靶位点，实现靶位点基因双链断裂[11]。同时，目的DNA片段在重组酶作用下与断裂双链发生同源重组从而被整合在基因组上，完成基因编辑。

1.3.1.1 gRNA质粒构建与目的DNA片段的获得

设计两条反向互补的单链DNA，退火后形成双链DNA，该双链两端由pGRB的同源序列组成，中间部分为靶位点的特定gRNA序列。双链DNA与线性化pGRB在同源重组酶作用下形成gRNA表达质粒。

使用Primer 5.0设计引物，以待编辑基因上下游序列为模板，设计上下游同源臂的引物；以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过聚合成酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法扩增待编辑基因的上下游同源臂和整合基因片段，后经重叠PCR制备重组片段。

1.3.1.2 重组菌株构建

将pREDCas9质粒电转导入大肠杆菌W3110感受态细胞中，经菌落PCR筛选出阳性转化子，并接种至LB培养基，32 ℃培养10～12 h后，接1～1.5 mL菌液转至100 mL 2×YT培养基中，32 ℃培养，当细菌OD600nm达0.1～0.2时，添加0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷溶液诱导重组酶表达，继续培养至OD600nm达到0.4～0.6左右收集菌体，制备电转感受态。将gRNA质粒和重组DNA片段加入电转感受态细胞中进行电转化，于1 mL复苏液中32 ℃复苏2 h。然后取100 μL菌液涂布至含奇霉素和氨苄青霉素抗性的LB平板，挑选单菌落进行菌落PCR验证，将筛选得到的正确阳性重组菌接至含0.2%阿拉伯糖和奇霉素抗性的LB培养基，诱导pREDCas9中的质粒消除系统切割pGRB质粒，最后将仅含pREDCas9质粒的菌株于42 ℃培养10～12 h，消除温敏性质粒pREDCas9，获得无质粒菌株。

1.3.2 L-Phe发酵

1.3.2.1 摇瓶发酵

将菌株接种至18 mm×180 mm的试管斜面培养基中，于37 ℃培养2 代，每代12 h，后将二代斜面中的菌株接种至装有30 mL种子培养基的500 mL圆底瓶中，37 ℃、200 r/min培养8～10 h。然后按10%～15%接种量转接至装有30 mL发酵培养基的500 mL挡板瓶中，37 ℃、200 r/min培养24 h。发酵培养基中添加终质量浓度为8 mg/L的苯酚红作为酸碱指示剂，培养过程中需根据培养基颜色变化手动补加氨水以维持培养基pH 7.0左右，当葡萄糖耗尽时，培养基颜色呈红色且不变色，通过移液枪一次性补加1 mL的60 g/100 mL葡萄糖溶液维持发酵进行。

1.3.2.2 发酵罐分批补料发酵

菌株活化后，用无菌水将茄形瓶中的菌落冲洗下来制成菌悬液，全部接种到装有3 L种子培养基的5 L发酵罐中进行菌体扩大培养，发酵过程中控制pH 7.0左右，温度恒定在37 ℃，溶氧保持在25%～35%之间，至种子OD600nm达到10～16时，按15%的接种量接入装有3 L发酵培养基的5 L发酵罐中进行发酵培养，发酵过程中维持pH 7.0左右，温度保持在37 ℃，溶氧控制在25%～35%之间。当罐中的葡萄糖耗尽时，开始以一定速率流加质量浓度80 g/100 mL的葡萄糖溶液，维持罐中葡萄糖质量浓度在0.1～5 g/L内。

1.3.2.3 发酵过程中检测与分析

发酵过程中菌体生物量通过紫外分光光度仪检测OD600nm。发酵液葡萄糖质量浓度通过SBA生物传感仪检测。发酵液L-Phe含量通过高效液相色谱仪检测，色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为10%乙腈溶液，柱温40 ℃，检测波长210 nm，流动相总流速1 mL/min，采用二元梯度洗脱的方法。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 L-Phe合成支路强化

按系统代谢工程思路对L-Phe合成途径进行模块化改造，首先对合成途径的后半段进行改造，即L-Phe合成途径中分支酸到L-Phe的反应。这一过程由分支酸变位酶/预苯酸脱水酶PheA和转氨酶TyrB共同参与完成，是L-Phe合成途径中的主要限速步骤之一。其中PheA受到L-Phe强烈的反馈抑制。此外，与L-Phe合成和转运相关酶的表达还受到抑制因子TyrR的抑制[12-13]。根据报道，可通过保留PheA酶的分支酸变位酶区（1～109位氨基酸）和预苯酸脱水酶区（110～285位氨基酸）解除L-Phe的反馈抑制[14-15]。

图2 过表达双功能酶PheA及转氨酶TyrB对L-Phe产量的影响Fig. 2 Effect of overexpression of bifunctional enzyme PheA and transaminase TyrB on L-Phe production

对此，首先以本实验室的大肠杆菌W3110为出发菌株，通过敲除该菌株乳糖操纵子中的lacI基因，获得菌株PHE1，以解除LacI阻遏蛋白对启动子Ptrc的阻遏调控作用。在此基础上，构建解除反馈抑制的pheA*片段，然后在tyrR位点将pheA*与tyrB串联成操纵子，由强启动子Ptrc启动转录，构建菌株PHE2。摇瓶发酵测试后，检测到L-Phe有积累。为验证其最适表达量，又在假基因gapC及yeeP位点分别整合了这2 种酶的双拷贝及三拷贝，均由Ptrc启动转录，分别构建了PHE3-1和PHE3-2。摇瓶结果如图2所示，PHE2的L-Phe产量为6.5 g/L，PHE3-1的L-Phe产量达8.8 g/L，较PHE2提高了36.22%。而PHE3-2的产量又下降至6.5 g/L，说明关键酶的表达不宜过强，由Ptrc启动子控制的关键酶PheA及TyrB双拷贝效果最好。

2.2 莽草酸合成途径优化

表1 莽草酸途径基因的改造对L-Phe生产的影响Table 1 Effects of modification of genes in the shikimate pathway on L-Phe production

莽草酸途径连接中心代谢途径和分支酸途径，是L-Phe合成途径的重要组成部分[16]。作为连接中心代谢途径与分支途径的中间通路，莽草酸途径的通畅对于平衡代谢通量分布，减少毒副产物（如莽草酸等）积累至关重要[17-18]。本研究通过对莽草酸途径中各反应酶的表达强度进行梯度优化，测试莽草酸途径中各基因的改造对L-Phe合成及菌体生长的影响。在PHE3-1的基础上，依次替换莽草酸途径各酶的启动子，从莽草酸途径后段向前逐步确定各酶最适活力，构建了表1菌株。摇瓶发酵结果如表1所示，其中PHE5-2（过表达5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶AroA）产量为9.3 g/L，较PHE3-1（8.4 g/L）提高了10.56%；在此基础上，依次对其余酶的表达量进行了优化，最终仅有PHE8-2（过表达3-脱氢奎宁脱水酶AroD）对产物合成产生了正向作用。PHE8-2的L-Phe产量达11.9 g/L，与PHE5-2相比提高了27.96%。推测改造后的正向菌株应对产量或生长有积极的影响。经过多轮优化筛选，最终确定在6 种酶中，仅有5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶AroA和3-脱氢奎宁脱水酶AroD可以通过适度强化提高L-Phe产量且不影响菌体生长，其余酶的表达水平已达最佳，无需优化。

莽草酸途径中，PEP和E4P在DAHP合成酶作用下缩合生成DAHP是L-Phe合成途径的另一限速步骤[19]。DAHP合成酶由3 种同工酶AroF、AroG、AroH组成，其中AroG占大部分酶活力，受到L-Phe的反馈抑制[20-21]。根据文献报道，将编码AroG蛋白的第180位丝氨酸突变为L-Phe可解除L-Phe的反馈抑制作用[22-23]。本研究以PHE8-2为出发菌，分别整合了由强启动子Ptrc控制的aroG*基因及其双拷贝，构建了菌株PHE10及PHE11。摇瓶发酵结果如图3所示，PHE10与PHE11的L-Phe产量分别为16.8 g/L与16.6 g/L，其中PHE10较PHE8-2（11.23 g/L）提高了49.77%，说明适度强化DAHP合成酶可显著提高L-Phe产量。

图3 增强DAHP合成酶表达对L-Phe合成的影响Fig. 3 Effects of enhanced expression of DAHP synthase on L-Phe synthesis

2.3 前体物供应增加

PEP作为合成芳香族氨基酸的前体物之一，同时还被多条代谢途径竞争，分流十分明显，仅有少部分PEP能够流向莽草酸途径，因此PEP的供应也是合成L-Phe的限制性因素之一[14]。中心代谢途径中一部分PEP会在丙酮酸激酶的作用下生成丙酮酸，随后进入三羧酸循环[24]。因此，为在增加PEP供应的同时减少对菌体生长的影响，仅敲除丙酮酸激酶（pykF与pykA编码）中的pykF基因，构建了菌株PHE12。摇瓶发酵结果如图4所示，PHE12产量达到20.5 g/L，比出发菌PHE10（16.94 g/L）提高了21.13%。说明敲除丙酮酸激酶可有效增加PEP供应，进而提升L-Phe产量。

图4 敲除丙酮酸激酶pykF对L-Phe合成的影响Fig. 4 Effect of pykF knockout on L-Phe synthesis

此外，中心代谢途径中丙酮酸也会在磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps的作用下反向生成PEP[25]。因此，本研究尝试在PHE12基础上用不同强度的启动子对pps基因进行强化，分别构建PHE13-1、PHE13-2和PHE13-3（分别由PBBa_j23106、Ptrp和Ptrc进行调控）。摇瓶发酵结果如图5所示，与ΔpykF不同，增强pps基因表达后，L-Phe产量呈不同程度的降低，而生长并未受到明显影响。由于PykF在丙酮酸激酶中占主要酶活力，在ΔpykF后，PEP生成丙酮酸的代谢流被减弱，胞内丙酮酸含量减少。而相应地，为保证生长不受影响，菌体通过自身调节机制强化了PEP到草酰乙酸的合成[26]。此时过表达磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps也再难产生更多PEP，限制了L-Phe产量。此外，胞内E4P供应不足时，也无法与PEP缩合生成DAHP，使反应向下进行。为了验证本研究推测，随后对转酮酶TktA进行了强化。

图5 增强磷酸烯醇丙酮酸合成酶表达对L-Phe合成的影响Fig. 5 Effects of enhanced expression of phosphoenolpyruvate synthase on L-Phe synthesis

与PEP不同，E4P在代谢网络中分流并不明显，可通过过表达转酮酶基因tktA增加E4P的供应[27-28]。为验证上述猜想，在PHE13-3的基础上尝试利用不同强度启动子控制转酮酶基因tktA，分别构建了PHE14-1和PHE14-2（分别由PtktA和PBBa_j23106进行调控）。摇瓶发酵结果如图6所示，增强E4P供应后，产量仍呈下降趋势，可以判断此前的E4P供应充足，不需要加强，且在ΔpykF后，通过强化磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps再难增加PEP供应。此外，在本课题组之前研究中，也尝试过敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶Ppc，以及利用其他酶代替PTS系统进行糖的摄取以增加PEP供应，而这些策略在增加PEP的同时会严重影响菌体的生长。因此仅保留ΔpykF菌株（PHE12）作为最终改造的无质粒、非缺陷型L-Phe工程菌株，并进行5 L发酵罐发酵测试。

图6 增强转酮酶TktA的表达对L-Phe合成的影响Fig. 6 Effect of enhanced expression of transketolase TktA on L-Phe synthesis

2.4 工程菌发酵罐发酵测试结果

为测试效果最佳的PHE12的综合生产性能，进行5 L发酵罐分批补料发酵培养（发酵过程无需添加抗生素及缺陷型氨基酸，降低了发酵生产成本）。如图7所示，发酵初期菌体生长迅速，于36 h OD600nm值达到最高，随后逐渐降低。发酵12 h后，L-Phe产量呈稳定趋势一直增长。生产至48 h后，L-Phe产量达81.8 g/L，生产强度达1.7 g/（L·h），糖酸转化率（以葡萄糖计）为0.24 g/g。

图7 工程菌PHE12在5 L发酵罐分批补料发酵曲线Fig. 7 Time course of fed-batch fermentation of the engineered strain PHE12 in a 5 L bioreactor

3 结 论

本研究按照系统代谢工程思路对L-Phe代谢途径进行模块化改造，构建了1 株非缺陷型、无质粒、高效合成L-Phe的大肠杆菌工程菌株。该菌株构建过程如下：1）通过在转录抑制因子TyrR位点处整合解除反馈抑制的双功能酶与转氨酶，增强了L-Phe的合成；2）通过对莽草酸途径各基因进行梯度强度优化，确定了各反应中酶的最适表达强度，同时确保了后半段代谢通路的通畅；3）通过引入解除反馈抑制的DAHP合成酶增强L-Phe的合成途径；4）通过敲除丙酮酸激酶PykF增加PEP的供应，进而增加L-Phe产量，以葡萄糖为碳源进行分批补料发酵48 h，工程菌PHE12的L-Phe产量达到81.8 g/L，糖酸转化率达0.24 g/g，生产强度达1.7 g/（L·h）。目前文献报道的L-Phe最高发酵水平为72.9 g/L，生产强度为1.4 g/（L·h）（发酵52 h），与该菌株相比，PHE-12的L-Phe产量提高了12.2%，生产强度较该菌株提高21.4%。与现有L-Phe工程菌株相比，该工程菌具备以下优点：1）菌株为非缺陷型且不含质粒，避免了抗生素及缺陷型氨基酸的使用；2）生产强度高。该工程菌的构建降低了生产成本，具有良好的工业化前景。