β-乳球蛋白聚乙二醇定点修饰物的制备及其抗原性变化

2021-01-20 08:15刘成梅江辛琳李冬梅钟俊桢罗舜菁
食品科学 2021年2期
关键词:巯基条带游离

刘成梅,江辛琳,李冬梅,周 磊,钟俊桢,吉 莉,罗舜菁,*

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047;2.江西丹霞生物科技股份有限公司,江西 鹰潭 335200)

牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应。在导致牛乳过敏反应的蛋白中,β-乳球蛋白(beta-lactoglobulin,β-LG)被认为是主要的过敏原[1]。采用共价修饰技术降低β-LG抗原性[2]已成为国际乳制品加工技术研究的重点。但常用共价修饰手段如糖基化[3]、磷酸化[4]等随机修饰,存在修饰位点选择性低、稳定性不理想、修饰产物不均一等问题。研究表明β-LG抗原性同时受线性表位和构象表位影响[5],共价修饰发生在不同位点会对蛋白构象及抗原性产生不同影响[6]。为明晰不同位点共价修饰对β-LG抗原性的影响,实现共价修饰对β-LG抗原性的有效调控,需采用定点修饰技术以制备均一化修饰产物。

聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)定点修饰技术,是能针对特定基团或专一位点进行修饰的共价修饰方法。PEG在人体内代谢简单、毒性小,具有较好的生物相容性、低免疫原性和生物学惰性,其安全性已经过FDA认证[7]。目前关于β-LG的PEG化研究较少,Nijs[8]和Zhong Junzhen[9]等利用第一代PEG随机修饰对β-LG进行修饰,但修饰很大程度上存在随机性,修饰产物多为不同修饰度及同分异构体的混合物且修饰率低[10]。本研究团队采用PEG定点修饰技术针对β-LG不同位点进行修饰以系统地探究不同位点对β-LG抗原性的影响,前期分别对β-LG的N-末端氨基[11]、谷氨酰胺残基[12-13]进行了定点修饰产物的制备,在单修饰产物的制备中,发现不同修饰条件会产生不同修饰度的修饰产物,修饰条件对产物修饰率及纯度影响极大,若选取不当还会导致修饰产物难以分离纯化。并且针对不同基团进行PEG修饰能不同程度改变β-LG构象并有效降低β-LG抗原性。

在PEG蛋白修饰常用基团中,巯基因其含量少成为PEG定点修饰中的理想位点[14],目前针对β-LG巯基使用PEG定点修饰的鲜见报道。并且β-LG第121位半胱氨酸(Cys121)游离巯基位于被97%人血清识别的主要抗原表位肽段AA102-124中[15],游离巯基或是探究不同结合位点对β-LG抗原性影响及实现β-LG致抗原性调控的关键位点。因此本研究针对β-LG Cys121游离巯基,选择5 kDa单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(methoxyPEG-maleimide,mPEG-MAL)对其进行定点修饰(图1),以期获得高修饰率β-LG PEG定点修饰产物,并对修饰前后β-LG抗原性进行探究。

图1 β-LG与mPEG-MAL共价结合示意图Fig. 1 Schematic diagram of β-LG/mPEG-MAL covalent binding

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳β-LGAB、兔抗β-LG IgG一抗、明胶 美国Sigma-Aldrich Chemistry公司;5 kDa mPEG-MAL北京键凯科技股份有限公司;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)试剂盒及4×上样缓冲液(含β-巯基乙醇)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记羊抗兔IgG酶标二抗、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 北京索莱宝科技有限公司;三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride,TCEP) 阿拉丁化工有限公司;乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)西陇科学股份有限公司;蛋白Marker 美国Thermo公司;所有试剂均为分析纯,实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Mini-PROTEAN小型垂直电泳仪、NGC Quest 10 Plus中高压层析系统、Enrich SEC70 10×300凝胶柱美国Bio-Rad公司;SP Sepharose Fast Flow色谱柱(25 mL)美国GE公司;Five Easy Plus pH计、ME104型电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Simplicity UV超纯水系统、ME104型电子分析天平、Amico Ultra-15超滤离心管 美国Millipore公司;SYC-A水浴恒温摇床 常州金坛精达仪器制造有限公司;HH-2型数显恒温水浴锅 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司;Heraeus Multifuge X1R高速冷冻离心机 美国Thermo公司;HF2000酶标仪 北京华安麦科生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 修饰反应条件优化

参考Natarajan等[16]的MAL法,稍作修改。β-LG与20 倍物质的量的mPEG-MAL反应,在0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)(pH 7.0,含2 倍物质的量TCEP及2 mmol/L EDTA)中4 ℃反应12 h。以此反应条件为基础进行单因素试验。

1.3.1.1 β-LG与mPEG-MAL反应物质的量比

根据1.3.1节方法,β-LG与mPEG-MAL分别以物质的量比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40在0.1 mol/L pH 7.0 PBS(含2 倍物质的量TCEP和2 mmol/L EDTA)中4 ℃反应12 h。分别取样考察β-LG与mPEG-MAL反应物质的量比对修饰反应的影响。

1.3.1.2 反应时间

根据1.3.1节方法,β-LG与mPEG-MAL以物质的量比1∶20在0.1 mol/L,pH 7.0 PBS(含2 倍物质的量TCEP和2 mmol/L EDTA)中4 ℃反应0、4、8、12、24、48 h。分别取样研究反应时间对修饰反应的影响。

1.3.1.3 pH值

根据1.3.1节方法,β-LG与mPEG-MAL以物质的量比1∶20在0.1 mol/L,pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 PBS(含2 倍物质的量TCEP和2 mmol/L EDTA)中4 ℃反应12 h。分别取样考察pH值对修饰反应的影响。

1.3.1.4 TCEP添加量

根据1.3.1节方法,β-LG与mPEG-MAL以物质的量比1∶20在0.1 mol/L,pH 7.0 PBS(含不同物质的量TCEP,TCEP为β-LG物质的量的0、1、2、3、4 倍和2 mmol/L EDTA)中4 ℃反应12 h。分别取样考察TCEP添加量对修饰反应的影响。

1.3.1.5 乙醇体积分数

根据1.3.1节方法,β-LG与mPEG-MAL以物质的量比1∶20在0.1 mol/L,pH 7.0 PBS(含2 倍物质的量TCEP,2 mmol/L EDTA及不同体积分数乙醇0%、5%、10%、15%、20%、25%)中4 ℃反应12 h。分别取样考察乙醇体积分数对修饰反应的影响。

1.3.2 SDS-PAGE测定样品

电泳凝胶浓缩胶5%,分离胶12%[17],将30 μL蛋白样品与10 μL 4×上样缓冲液(含β-巯基乙醇)混合,于100 ℃水浴锅中煮沸7 min至变性,冷却后离心2 min;加样,每孔约10 μL样品;浓缩胶电泳80 V、15 min,分离胶以120 V约50 min电泳至使溴酚蓝条带到达电泳胶底部;染色,取出凝胶置于考马斯亮蓝染色液中染色2 h左右;脱色,使用蒸馏水漂洗凝胶数次后,置于脱色液中脱色直至蛋白条带清晰。

1.3.3 凝胶过滤色谱分析

参考甘克明[11]和薛晓莹[18],通过凝胶过滤色谱分析不同反应条件下修饰产物的修饰率。反应混合液通过Bio-Rad Enrich SEC70 10×300凝胶柱进行分析,洗脱缓冲液为0.01 mol/L的PBS,流速为1 mL/min,检测波长为280 nm。修饰率的计算,通过自带软件积分计算产物各组分峰面积。

1.3.4 阳离子交换层析

修饰产物通过阳离子交换层析进行分离纯化得到,参考Zhong Junzhen[9]和Yu Pengzhan[19]等的方法,将修饰混合液经阳离子层析交换柱SP Sepharose Fast Flow进行分离。洗脱液A:0.04 mol/L,pH 4.5乙酸钠缓冲液;洗脱液B:0.04 mol/L,pH 4.5乙酸钠缓冲液+1.0 mol/L NaCl;首先用洗脱液A平衡柱子,流速为2 mL/min;进样,使用洗脱液B 进行梯度洗脱,洗脱梯度为0%~100%,流速为2 mL/min,洗脱90 min,检测波长为280 nm。收集洗脱峰,使用SDS-PAGE对洗脱峰进行鉴定。大量收集样品后使用截留分子质量10 kDa的Amico Ultra-15超滤离心管对目标峰产物于4 ℃、6 000 r/min离心15 min,并使用0.1 mol/L pH 7.0 PBS置换样品中洗脱液,浓缩得到样品。

1.3.5 游离巯基含量测定

使用Ellman试剂对修饰前后β-LG样品游离巯基含量进行测定。将样品配制为1 mg/mL,取50 μL待测样品与加入4 mL Tris-Gly缓冲液中,于25 ℃恒温1 h。加入25 μL 0.01 mol/L 5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)混合均匀,静置。使用紫外分光光度计测定检测波长为412 nm处吸光度(A412nm)。以5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)在波长412 nm处消光系数13 600 L/(mol·cm)计算游离巯基含量。游离巯基含量以每克蛋白的物质的量计(μmol/g)[20-21]。

1.3.6 抗原性测定

采用间接竞争ELISA法测定修饰前后蛋白样品抗原性。包被:每孔加入100 μL 2.5 μg/mL包被抗原4 ℃过夜;洗板,拍干,封阻:每孔加入250 μL 1%明胶,37 ℃温育1 h。洗板,拍干,每孔加入50 μL待测样品及50 μL兔抗β-LG抗体(1∶5 000稀释),37 ℃温育1 h;洗板,拍干,每孔加入100 μL HRP标记羊抗兔酶标二抗(1∶7 000稀释),37 ℃温育2 h;洗板,拍干,每孔加入100 μL TMB显色液,37 ℃避光反应15 min;终止反应:每孔加入100 μL 1 mol/L H2SO4溶液;使用酶标仪于波长450 nm处测定吸光度。每个样品平行做3 次,取平均值。以不同浓度梯度β-LG对数为横坐标,各浓度梯度β-LG对应吸光度为纵坐标绘制标准曲线。抗原性变化率按下式[22]计算:

式中:A0为无竞争对照孔吸光度;A1为β-LG吸光度;A2为待测样品吸光度。

1.4 数据统计与分析

实验数据均为3 次重复的平均值,使用Origin 9.0软件作图,使用SPSS 17.0软件分析数据显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 β-LG与mPEG-MAL反应物质的量比对修饰反应的影响

图2 β-LG与mPEG-MAL反应物质的量比对SDS-PAGE(a)及修饰率(b)的影响Fig. 2 Effect of molar ratio of β-LG to mPEG-MAL on modification efficiency

如图2a所示,条带1~6对应修饰率分别为3.2%、11.3%、18.6%、26.3%、41.2%、41.9%(图2b)。产物修饰率随mPEG-MAL添加比例的增加而升高,反应物质的量比达1∶30后,增加PEG的量修饰率变化不明显。因此选择1∶30作为最佳蛋白与PEG物质的量比。

2.1.2 反应时间对修饰反应结果的影响

图3 反应时间对SDS-PAGE(a)及修饰率(b)的影响Fig. 3 Effect of reaction time on modification efficiency

如图3a所示,条带1~6对应修饰率分别为4.1%、18.3%、23.6%、31.4%、42.1%、42.8%(图3b)。当反应时间超过24 h后,β-LG与mPEG-MAL反应完全,PEG修饰产物的量达到最大。因此选择24 h作为最佳反应时间。

2.1.3 pH值对修饰反应的影响

如图4a所示,条带1~6对应修饰率分别为33.8%、32.1%、34.9%、36.7%、34.2%、35.5%(图4b)。研究显示β-LG对溶液pH值变化敏感,在生理pH值下β-LG以非共价二聚体和单体平衡状态存在,pH值改变可引起β-LG形态在单体与聚集状态间转变[23-24]。而实验中不同pH值下的修饰率无显著变化,说明此反应条件可能较好地保持β-LG在不同pH值溶液中的稳定性。也可能因PEG链包裹在蛋白外部能形成一层独特的水化层,其对蛋白产生空间屏蔽的保护作用[25],使得pH值变化对反应产物修饰率影响不显著,因此选择生理条件pH 7为最佳反应pH值。

图4 反应pH值对SDS-PAGE(a)及修饰率(b)的影响Fig. 4 Effect of reaction pH on modification efficiency

2.1.4 TCEP添加量对反应结果的影响

图5 TCEP添加量对SDS-PAGE(a)及修饰率(b)的影响Fig. 5 Effect of TCEP concentration on modification efficiency

因β-LG蛋白分子含有一游离巯基,β-LG在溶液中常以单体和二聚体形式共同存在[24]。在反应中添加还原剂TCEP,能有效避免蛋白分子间二聚体的形成[26],以便于mPEG-MAL与β-LG游离巯基的连接。将不同TCEP反应产物进行SDS-PAGE及凝胶过滤色谱分析,图5a中条带1~5对应修饰率分别为5.9%、17.9%、32.5%、42.1%、43.2%(图5b)。随着TCEP添加量的增加,反应产物修饰率得到显著提升,当TCEP添加量至蛋白3 倍后,修饰率无显著变化,因此选择3 倍物质的量为本实验最佳TCEP添加量。

2.1.5 乙醇体积分数对反应的影响

图6 乙醇体积分数对SDS-PAGE(a)及修饰率(b)的影响Fig. 6 Effects of ethanol concentration on modification efficiency

如图6a所示,条带1~6分别对应修饰率为35.6%、37.1%、37.8%、40.1%、39.8%、49.2%(图6b),乙醇体积分数为25%时修饰率达到最高为49.2%。彭飞[27]在水溶液中添加20%比例乙醇溶液使干扰素beta 1b的PEG单修饰产物产率提高20%,一定比例乙醇溶剂能使蛋白二级结构松散发生可逆性改变从而提高修饰率。在本实验中,当乙醇体积分数达30%时,蛋白出现大量不溶沉淀,说明高浓度乙醇环境蛋白溶解性下降,不适合进行修饰反应,因而未对更高浓度进行条件优化实验。

综上,通过单因素试验,研究不同反应条件对该修饰反应的影响,确定本实验最佳修饰条件:β-LG与mPEG-MAL物质的量比1∶30,在0.1 mol/L、pH 7.0的PBS(含3 倍物质的量的TCEP,25%乙醇溶液及2 mmol/L EDTA)中4 ℃反应24 h。

2.2 修饰产物的分离纯化及修饰率鉴定

β-LG等电点在5.1~5.3左右[28],修饰所用PEG化合物为电中性不带电,经修饰后,PEG会屏蔽蛋白表面电荷使蛋白表面所带电荷有所区别[11],因此本实验可采用阳离子交换层析分离纯化β-LG-MAL修饰产物。实验中,β-LG在pH 4.5的缓冲液中带正电,吸附于带负电的层析介质中;而β-LG-MAL修饰产物经PEG修饰后与层析介质的结合强度会有所减弱,因此β-LG-MAL修饰产物会先于未修饰的蛋白而被洗脱下来[28]。

图7 阳离子交换层析纯化β-LG-MAL的单修饰产物(a)和洗脱峰SDS-PAGE(b)Fig. 7 Cation exchange chromatogram of PEGylated β-LG (a) and SDS-PAGE analysis of eluates (b)

根据单因素试验优化得出最佳修饰条件,制备β-LG PEG定点修饰产物,并对优化产物进行分离纯化。将修饰混合液经阳离子层析交换柱SP Sepharose Fast Flow进行分离纯化,如图7所示,得到2 个洗脱峰,并通过SDSPAGE对洗脱峰进行鉴定验证,分析显示保留时间较短的峰1为β-LG-MAL的单修饰产物(图7b,条带2),分子质量约为28 kDa;峰2为未反应完全的β-LG(图7b,条带1),分子质量约为18 kDa;β-LG-MAL的单修饰产物表观分子质量高于单点修饰产物的理论分子质量,是因为当PEG溶于溶液中时,分子中的乙氧基单元易于水分子结合,使其水化半径增大,表观分子质量约为PEG实际分子质量的2~3 倍,因此本实验中制得产物为β-LGMAL的单修饰产物。图6a显示阳离子交换层析分离效果较好,优化产物修饰率达64.1%,远高于β-LG随机修饰的修饰率38%[29]。

2.3 修饰产物纯度的鉴定

大量收集图7a中峰1,使用截留分子质量为10 kDa的超滤离心管于冷冻离心机中以6 000 r/min离心15 min,浓缩得到β-LG-MAL的单修饰产物样品(图7b,条带3)。取样通过凝胶过滤色谱测定修饰产物纯度,如图8所示,当洗脱液体积为9.5 mL时所出峰为单修饰产物β-LG-MAL,通过柱层析系统软件峰面积计算样品纯度达94%。

图8 β-LG-MAL单修饰产物高效凝胶过滤色谱图Fig. 8 High performance liquid chromatogram of cysteine-specific PEGylated β-LG

2.4 修饰位点鉴定

β-LG中,每个β-LG单体中含有5 个半胱氨酸残基,其中Cys66和Cys160、Cys106和Cys119在结构紧密的β-LG内部两两形成了2 个二硫键[30],仅有一游离巯基Cys121位于蛋白α-螺旋与β-折叠结构交界面的疏水空腔[31],第121位半胱氨酸游离巯基是实现PEG定点修饰的理想位点。目前未有对β-LG巯基进行PEG定点修饰的相关研究,因此参考蔡小飞等[22]采用三硝基苯磺酸法测定氨基含量确定PEG衍生物与β-LG氨基的结合情况,因此本实验通过对游离巯基含量进行测定以确定PEG衍生物与β-LG游离巯基的结合情况。

实验中所用mPEG-MAL是一种巯基特异性PEG衍生物。mPEG-MAL与Cys121游离巯基的特异性结合结果验证可以体现在两方面:首先,对修饰产物进行电泳鉴定发现所得产物为仅有一单一条带的单修饰产物。若PEG结合在非Cys121的任何巯基,说明蛋白内部二硫键打开,存在多个游离巯基,则2.1.1节中在mPEG-MAL加入过量情况下,修饰产物的SDS-PAGE不应为单一条带,而是出现多修饰条带,电泳鉴定发现所得产物仅有一单一条带说明本实验中蛋白内部二硫键保持完好。再者,在蛋白内部二硫键保持完好的情况下,β-LG游离巯基含量即β-LG唯一游离巯基Cys121游离巯基的含量。对分离纯化后产物进行游离巯基含量测定显示,经PEG修饰后β-LG游离巯基含量由52.3 μmol/g降为0.3 μmol/g(P<0.05)(表1),说明修饰产物中Cys121游离巯基含量几乎降为零,游离巯基已与mPEG-MAL发生共价结合,因此未被检测到。综上,可验证Cys121游离巯基已与mPEG-MAL发生特异性结合。

表1 游离巯基含量测定结果Table 1 Results of determination of free sulfhydryl group

2.5 修饰前后β-LG抗原性分析

图9 PEG修饰对β-LG抗原性影响Fig. 9 Effect of PEGylation on antigenicity of β-LG

研究显示PEG修饰能有效降低蛋白免疫原性[8],然而本实验经mPEG-MAL对β-LG Cys121游离巯基定点修饰后,β-LG-MAL抗原性显著提高约25.9%,如图9所示。本团队前期采用PEG定点修饰β-LG谷氨酰胺残基得到产物β-LG-NH2,β-LG-NH2抗原性显著下降59.04%[12];对β-LG的N-末端氨基进行修饰得到β-LG-ALD,β-LG-ALD抗原性显著下降53.8%[11],该2 种位点修饰使蛋白抗原性下降原因都归结于PEG链对于蛋白的空间屏蔽作用,掩盖了β-LG表面部分抗原决定簇。本实验中,PEG的巯基定点修饰却没有因PEG链的屏蔽使抗原性下降,说明结合位点对β-LG抗原性的影响较PEG链的屏蔽作用更为显著。β-LG中肽段AA41-46、AA102-124和AA149-163为主要抗原表位,分别为92%、97%、89%的人血清识别[15]。实验中Cys121游离巯基位于被97%人血清识别的主要抗原表位肽段AA102-124中[15],并且由于β-LG致敏性同时受线性表位和构象表位影响[5],因此可能是修饰后原处于蛋白内部的致敏位点暴露,或者有新的构象致敏表位形成导致β-LG致抗原性显著提升。

3 结论与讨论

本研究采用PEG定点修饰技术,使用5 kDa mPEGMAL对β-LG第121位游离巯基进行修饰。通过单因素试验不同条件对修饰反应结果的影响,得到最佳修饰条件:β-LG与mPEG-MAL物质的量比1∶30,在0.1 mol/L、pH 7.0的PBS(含3 倍物质的量的TCEP,25%乙醇及2 mmol/L EDTA)中4 ℃反应24 h,在此条件下蛋白修饰率达64.1%,对比β-LG的PEG随机修饰定点修饰率有大幅提高,约为传统修饰的1.7 倍。阳离子交换层析显示,实验中所选择洗脱条件及溶液对β-LG-MAL单修饰产物分离纯化效果较好,收集纯化产物对样品纯度进行鉴定,所得样品纯度达94%。通过电泳联合巯基含量检测对修饰位点进行鉴定确定β-LG第121位游离巯基与mPEG-MAL发生特异性结合。

β-LG-MAL抗原性测定结果前期实验截然不同,与前期不同位点修饰进行比较,发现共价位点对蛋白抗原性的影响显著高于PEG链对抗原决定簇的屏蔽作用。经巯基修饰后β-LG抗原性提升25.9%,抗原性的提升可能由于修饰后原处于蛋白内部的致敏位点暴露,或者是新蛋白构象致敏表位的形成。本实验说明与普通共价修饰相比,PEG定点修饰能有效探究不同位点对β-LG抗原性的影响,而对于巯基修饰致使β-LG抗原性提升的机理验证,还需下一步对修饰前后β-LG构象变化等进行探究以确定β-LG构象、结合位点与抗原性之间的关系。

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