超高效液相色谱-串联质谱法同时测定陈年老茶中16种真菌毒素残留

刘文静，黄 彪，傅建炜*，韦 航，黄财标

（福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，福建省农产品质量安全重点实验室，福建省茶叶质量检测与技术推广中心，福建 福州 350003）

中国是茶叶的生产、出口和消费大国，近年来关于茶叶尤其普洱茶、茯砖茶等发酵茶中真菌毒素污染已引起消费者的关注[1]。虽然茶叶加工过程干燥环节可能杀灭茶中的大多数微生物，但若包装、贮藏不当，尤其茶叶吸湿受潮之后，仍可能受到真菌侵害并产生有毒的代谢产物[2]。陈年老茶亦称年份茶，是指存储一段时间后具有保健功能的茶叶，由于其需要存储过程较长，存储不当将有可能导致茶叶发霉变质，产生毒素。迄今发现超过400 种真菌毒素[3]，主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏马毒素等，这些毒素对人体具有致畸、致癌、致突变、中毒性肾损害、肝细胞毒性、免疫抑制和生殖紊乱等慢性毒性[4-6]。有研究表明茶叶中主要污染的真菌毒素为黄曲霉毒素[7]、赭曲霉毒素[8]、伏马毒素[9]、玉米赤霉烯酮[10]、T-2毒素[11]等。

目前，茶叶中真菌毒素的检测方法主要包括薄层色谱法[12-13]、酶联免疫法[14-15]、液相色谱法[9,16]、液相色谱-串联质谱法[17-18]等。其中液相色谱-串联质谱联用技术与其他方法相比，定量更加准确，选择性和灵敏度也更高，已逐渐取代传统的液相色谱方法应用于茶叶中真菌毒素的检测。采用高效液相色谱-串联质谱技术已建立了茶叶的赭曲霉毒素[18-19]、黄曲霉毒素[20-21]和玉米赤霉烯酮[22-23]的检测方法。但上述检测方法均针对单一毒素进行检测，而同时检测不同茶叶中多类、多组分真菌毒素低污染残留的分析方法鲜见报道，一些真菌毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇[11,24]、玉米赤霉烯酮[25]仍然以酶联免疫法进行检测，由于茶叶中多酚类物质及其他次生代谢产物的干扰，酶联免疫法存在假阳性结果，还需进行色谱确证[5]。QuEChERS（quick, easy, cheap,effective, rugged, and safe）技术是由化学家Lehotay和Anastassiadas于2003年提出[26]，目前，根据真菌毒素和样品基质的理化特性，开发多真菌毒素的QuEChERS技术正逐渐成为真菌毒素研究领域的热点[27]。本实验针对茶叶中可能出现的16 种真菌毒素收集不同茶叶生产厂家的陈年老茶为研究对象，建立QuEChERS技术进行前处理，利用超高效液相色谱-串联质谱同时测定陈年老茶中16 种真菌毒素的方法，以期为陈年老茶的安全卫生分析提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

陈年老茶购自福建省各茶叶店、茶厂。乌龙茶38 份：其中2005—2010年间存储茶叶样品16 份，2011—2015年间存储的样品17 份，2016—2018年间存储的样品5 份。白茶53 份：其中1993—2010年间存储茶叶样品16 份，2011—2015年间存储的样品18 份，2016—2018年间存储的样品19 份。红茶30 份：2004—2010年间存储茶叶样品12 份，2011—2015年间存储的样品11 份，2016—2018年间存储的样品7 份。茶叶粉碎后贮藏于马口铁茶叶罐中。

16 种毒素标准品（纯度＞98%）：伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、杂色曲霉毒素、桔青毒素、雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素、T-2毒素，上述16 种标准品均购自美国Romer公司。

QuEChERS提取盐包（4 g硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸二钠盐水合物）、dSPE净化管（150 mg硫酸镁、25 mg PSA、25 mg C18、7 mg GCB）、Oasis PRIME HLB小柱（3 mL，150 mg）、Oasis HLB净化柱（6 mL，150 mg）、甲酸（质谱纯）美国Waters公司；PriboFast®Multi-Toxin IAC多毒素免疫亲和柱 中国Pribolab公司；Mycosep 226柱（AflaZon+Multifunctional Coumns, 25 per pkg） 美国Romer Labs公司；GHP滤膜（0.2 μm） 美国颇尔公司。

甲醇、乙腈（均为质谱纯） 德国Merck公司；超纯水（实验室一级水）由Millipore超纯水机制备。

1.2 仪器与设备

UPLC H-Class超高效液相色谱-串联质谱仪、ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美国Waters公司；TDL-5-A型低速大容量离心机 上海安亭科学仪器公司；Direct-Q®3UV型纯水仪中国密理博有限公司 。

1.3 方法

1.3.1 茶叶样品处理

茶叶样品粉碎后过筛至粒度250 μm备用，每份样品量需大于1 kg，称取5 g茶叶样品装入50 mL离心管中，加入10 mL水和10 mL甲酸-乙腈（10∶90，V/V）溶液置于自动振荡器中振摇10 min。加入QuEChERS提取盐包，振摇1 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液进行待净化。安装Oasis PRIME HLB小柱，取约0.5 mL上清液通过Oasis PRIME HLB小柱，弃去滤液，然后再取1 mL上清液，再次通过小柱并收集滤液。将滤液移到含有混合吸附剂的dSPE净化管中，10 000 r/min离心10 min，滤液过0.2 μm滤膜，待上机进样。

1.3.2 标准溶液配制

标准储备液配制：将16 种真菌毒素分别用甲醇稀释至质量浓度为100 μg/mL标准储备液，-20 ℃以下避光保存，根据后续实验需要，各取不同体积毒素储备液配制混合标准工作液置于10 mL棕色储液瓶中，避光备用。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3C18柱，柱温40 ℃；样品温度15 ℃，进样体积2 μL，分析时间8 min；流速0.4 mL/min；流动相A：0.1%甲酸溶液，流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5 min，98% A，2% B；0.5～5.0 min，98%～5% A，2%～95% B；5～8 min，5%A，95% B；8.0～8.01 min，5%～98% A，95%～2% B；8.01～10 min，98% A，2% B。

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子源，正离子模式；检测方式：多反应离子监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；毛细管电压1.5 kV；锥孔气流：氮气，流速50 L/h；离子源温度1 2 0 ℃；脱溶剂气温度5 0 0 ℃，流量1 000 L/h；碰撞气：高纯氩气。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

根据16 种真菌毒素分子的化学电离性质，分别在电喷雾离子源正/负模式下采用全扫描模式方式选择母离子、子离子扫描模式对子离子及碰撞能量、锥孔电压等质谱参数进行优化，发现所有毒素在正离子模式下响应值均高于负离子模式，最终确定16 种真菌毒素的母离子、定性离子和定量离子参数，见表1。伏马毒素B2与伏马毒素B3，离子通道相接近，保留时间分别在5.22 min和3.03 min可以有效分离，其余化合物在各自的离子通道下不存在相互干扰，符合欧盟2002/657/EC号决议《质谱分析方法鉴定点数》中对待测物定性及定量的要求。

表1 不同真菌毒素检测质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for 16 mycotoxins

2.2 流动相的选择

分别选择甲醇-纯水和乙腈-纯水作为洗脱流动相，比较2 个流动相体系对分离效果的影响。实验表明：以甲醇-纯水为流动相时，黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1的响应值显著降低；乙腈-纯水为流动相时，伏马毒素B2、伏马毒素B3无法完全分离。可见以纯水作为流动相时，离子化效率较差，灵敏度低。为增强各组分物质离子化强度，本实验在水溶液种添加甲酸（终体积分数分别为0.1%）。结果发现，加入0.1%甲酸溶液有利于抑制真菌毒素与色谱柱的静电作用，避免拖尾现象，伏马毒素峰形对称性明显得到改善；并可以增强黄曲霉毒素的响应值。因此本实验最终选择甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相时，16 种毒素的色谱峰形和响应强度均理想，保留时间稳定，离子通道相接近的伏马毒素B2与伏马毒素B3可以充分分离。色谱条件优化后的真菌毒素总离子流色谱图如图1所示。

图1 真菌毒素总离子流色谱图Fig. 1 Total ion current chromatograms of mixture of 16 mycotoxins

2.3 提取条件优化

在实验过程中，提取溶剂的选择直接影响回收率的高低，为了获得尽可能高的回收率，必须选择提取效率高的溶剂。本实验比较了乙腈、甲醇作为提取溶剂，实验发现甲醇作为质子化溶剂相比乙腈具有更好的溶解性，但易将茶叶中的酸、醇、酚类物质提取出来而导致提取液中杂质较多；乙腈提取液相比甲醇提取液的脂肪和色素较少，有利于后续步骤的盐析和净化，最终选择乙腈作为提取溶剂。

部分毒素含羧基基团，对提取溶剂中酸度敏感，因此添加甲酸到提取溶剂中可以增强伏马毒素、赭曲霉毒素等含有羧基集团毒素的稳定性及回收率。从表2可知，提取溶剂中的甲酸含量对不同种类毒素回收率的影响不同，其中，4 种黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和镰刀菌烯醇受甲体积分数度变化的影响较小；其余10 种毒素均随提取剂中甲酸浓度的增加而增加，但是当提取剂中甲酸体积分数达15%时，雪腐镰刀菌烯醇、桔青毒素、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素、T-2毒素的回收率下降，且与甲酸体积分数10%时相比达差异显著水平（P＜0.05）。因此本实验选择10%甲酸-乙腈作为提取溶剂。

表2 16 种真菌毒素在不同甲酸含量提取剂下的回收率Table 2 Recoveries of 16 mycotoxins extracted by acetonitrile with different formic acid concentrations

2.4 净化柱选择

采用Oasis PRIME HLB净化柱第一步净化，可以有效去除茶叶中大分子脂类杂质，再通过dSPE净化管，净化管含硫酸镁成分可去除基质中水分，PSA去除茶叶基质中的糖类和酸性成分，C18主要吸收剩余残留脂类成分，GCB主要去除茶叶中色素成分，应用上述净化方法可以达到满意回收率效果。本实验以乌龙茶提取液配制基质标准溶液比较多毒素免疫亲和柱[28]、Mycosep 226柱[29]、Oasis HLB净化柱和Oasis PRIME HLB净化柱，结果如表3所示，多毒素免疫亲和柱可测的毒素种类不能覆盖全部待测的16 种毒素，且前处理较为复杂，回收率低；Mycosep 226柱净化对黄曲霉毒素G2和玉米赤霉烯酮回收率较低，去除色素效果也不理想；Oasis HLB小柱净化效果不理想，并对毒素有吸附作用，导致回收率低，达不到实验要求。因此本实验采用Oasis PRIME HLB净化柱结合dSPE净化管方法可以降低茶叶复杂基质对毒素提取的干扰，达到净化效果。

表3 4 种净化柱对16 种真菌毒素回收率的影响Table 3 Effects of 4 purification columns on the recoveries of 16 mycotoxins

2.5 基质效应

图2 16 种真菌毒素的基质效应Fig. 2 Matrix effects of 16 mycotoxins

以不含毒素的乌龙茶、红茶、白茶作为基质空白，采用相同处理方法加入毒素混合标准溶液和流动相溶液，利用二者标准曲线斜率的比值评价不同茶叶基质对毒素的基质效应，比值一般在0.8～1.2定为基质效应不明显，当比值大于1.2视为基质增强效应，比值小于0.8视为基质抑制效应[30]，测定结果如图2所示，3 类茶叶中伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3、HT-2毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇基质效应均大于1.2，增强效应的毒素种类约占31.3%，因此必须去除茶叶的基质干扰。本实验采用基质匹配的标准溶液进行校准定量，根据成分补偿基质效应，提高实验回收率水平。

2.6 标准曲线、检出限、定量限结果

依据样品中16 种毒素基质效应强弱，配制不同浓度的混合标准溶液，以不同种茶叶空白基质提取液稀释标准品母液，得到标准曲线工作液。按照1.3.3节条件进样分析，以各组分的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别绘制出标准工作曲线。根据质谱MRM模式下响应不同，将配制好的最低浓度标准溶液添加到茶叶样品进行处理进样，根据真菌毒素在不同茶叶基质中最低添加浓度计算本方法的检出限，根据茶叶基质标曲的最低点确定本方法的定量限。结果显示，16 种真菌毒素的基质标准工作液在各自范围内均呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999。由表4可知，方法检出限在0.03～7.00 µg/kg之间，其中，黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮的检出限和定量限均低于GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量中的指标》[31]。

表4 真菌毒素的线性方程、检出限和定量限（n=6）Table 4 Linear equations, LODs and LOQs of 16 mycotoxins in tea (n= 6)µg/kg

2.7 方法的加标回收率实验

由于不同种类茶叶的基质效应具有一定的差别，因此茶叶中不同种类真菌毒素的定量限不同。本实验根据真菌毒素在不同种类茶叶中定量限，设计低、中、高3 个水平进行加标回收率实验，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。如表5所示，16 种真菌毒素的加标回收率为63.4%～109.7%，RSD为1.7%～11.3%，说明本实验方法满足实验要求。

表5 不同种类茶叶的加标回收率及精密度（n=3）Table 5 Recoveries and precision of 16 mycotoxins spiked into different tea samples (n= 3)

续表5

2.8 茶叶实际样品检测结果

检测福建省各地区共计121 份陈年老茶样品（乌龙茶38 份、白茶53 份、红茶30 份），其中1 份乌龙茶样品检出黄曲霉毒素B1，含量为34.0 µg/kg，参考GB 2761—2017的限量标准（5.0～20.0 µg/kg）超过限量值[31]，1 份红茶样品检出赭曲霉毒素A，含量为1.6 µg/kg，参考GB 2761—2017的标准（5.0 µg/kg）未超限量值[31]。陈年老茶贮藏年份较长，放置环境发生变化或包装损坏都可能导致茶叶受到真菌污染从而产生毒素危害人类健康。

3 结 论

本实验建立一种超高效液相色谱-串联质谱法测定不同种类陈年老茶中16 种真菌毒素的方法。样品经甲酸-乙腈（10∶90，V/V）溶液提取，加入QuEChERS盐包振摇离心，提取液过OASIS PRIME HLB小柱和dSPE净化管处理，以ACQUITY UPLC HSS T3C18色谱柱分离，采用电喷雾正离子模式扫描，MRM模式测定，茶叶基质匹配标准溶液，外标法定量。16 种真菌毒素在各自质量浓度范围内呈良好线性关系。采用QuEChERS方法提取结合OASIS PRIME HLB小柱和dSPE净化管双重净化的前处理方法，成本远低于目前普遍采用的免疫亲和柱，操作更简单，无需活化和平衡步骤，可除去大部分基质干扰物，并且溶液流速更快，使得整个操作更顺畅、更快速；采用高灵敏的超高效液相色谱-串联质谱分析方法同时测定16 种真菌毒素，提取时间短，20 min内即可完成，极大的提高测试的通量；经过优化后方法16 种真菌毒素的检出限达到0.03～7.00 µg/kg，灵敏度较高，能满足产品质量监督的要求。

QuEChERS是一种快速、简单、廉价、高效、可靠和安全的分散固相萃取技术[32]，分为提取、盐析和净化3 个步骤，提取是QuEChERS技术重要的组成部分，提取液的提取效率决定着最终分析结果的准确性。对于极性范围敏感的目标样品提取时，需在提取液中添加辅助试剂（乙酸、甲酸和甲醇等）以增强联合提取的效果[33]。本实验检测发现，在甲酸添加量为1%～10%范围内，16 种毒素回收率的平均值呈上升趋势，超过10%略有下降，因此选择10%甲酸-乙腈作为提取溶剂，使16 种真菌毒素均有较高的回收率。

本实验在陈年老茶中检出真菌毒素，说明陈年老茶存在真菌毒素污染的安全隐患，目前针对茶叶中毒素的限值还没有相关标准，因此极有必要建立茶叶中的真菌毒素限量标准及检测标准。