pH 值对酱油中呈味肽种类和呈味特性的影响

汪 卓，陈楚锐，许立锵，庄沛锐，周文斯，崔 春,*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640；2.广东真美食品股份有限公司，广东 潮州 521000）

酱油是以大豆或者豆粕等植物蛋白为原料，辅以面粉、小麦、麸皮等淀粉质原料，经过微生物发酵作用，生产出的一种含有多种氨基酸、呈味肽、有机酸和还原糖且具有特殊色、香、味的调味品[1-4]。酱油的滋味鲜美，主要是由于大豆蛋白或小麦蛋白在发酵酶解过程中分解产生了大量的呈味肽和游离氨基酸[5]。

呈味肽是指能够改善或掩盖食品感官特性的寡肽类，其分子质量一般低于5 000 Da[6]。目前，已知的呈味肽主要有咸味肽、酸味肽、甜味肽、苦味肽、鲜味肽以及浓厚感肽[7-8]。其中，鲜味肽和浓厚感肽是酱油中重要的呈味肽[9-10]。鲜味肽可以减弱苦味，具有显著的增鲜、增香作用；浓厚感肽能够显著增加食物浓厚感、口感复杂性及丰富性等。呈味肽的呈味特性与其相对分子质量，氨基酸组成、氨基酸序列、空间结构等有关[11-14]。因此，研究酱油中的呈味肽，并对呈味肽的分子质量及氨基酸序列进行测定分析，有助于进一步探究酱油中的呈味物质及其呈味机理。

课题组前期研究发现高盐稀态酱油酿造前期对酱醪进行低温胁迫处理可促进米曲霉自溶；提高酱醪中蛋白酶和谷氨酰胺酶活力，谷氨酸含量明显增加；提升了酱油原油的鲜味[15]。在此基础上，本实验利用固相萃取（solid phase extraction，SPE）法结合超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）联用技术研究发酵pH值对低温胁迫法生产酱油中呈味肽种类和呈味特性的影响，以期为高品质酱油的生产提供理论和方法指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Oasis MAX混合型阴离子SPE柱（6 mL/500 mg）美国Waters公司；甲酸、乙腈（均为色谱纯） 美国Sigma公司；甲醇、氨水、甲酸（均为色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；二氯甲烷（色谱纯）天津市福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

ME204E分析天平 梅特勒-托力多仪器（上海）有限公司；TS100微型旋涡混合仪器 杭州瑞诚仪器有限公司；HL-6恒流泵 上海精科实业有限公司；UPLCMS/MS联用仪 美国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 低温胁迫酱油的制备

将已浸润的豆粕高温灭菌后与大曲混合，置于霉菌培养箱中进行制曲。将所得大曲平均分为2 份，第1份按大曲、水质量比为1∶2.5混合均匀后，酱醪发酵初期9 d放在4 ℃冰箱进行控温发酵，之后与质量分数为22%的盐水以1∶3.05质量比混合，使最终醪液的盐质量分数达到16%，并放在25 ℃的恒温发酵箱进行保温发酵，每2～3 d用10 mol/L NaOH溶液调控酱醪pH 6.5左右，发酵90 d，得到调控pH值酱醪；第2份所有发酵条件均与第1份相同，但不调节pH值，发酵90 d，得到自然pH值酱醪。

1.3.2 SPE技术分离呈味肽

收集两组酱油样品，离心过滤，分别取0.3 mL稀释于50 mL蒸馏水中。

参考Frerot等[16]的方法并稍作修改。采用Oasis MAX混合型阴离子SPE柱分离两组酱油样品中的鲜味肽和浓厚感肽，操作参数见表1。洗脱出的酸性组分经0.22 μm滤膜过滤后置于样品瓶中，4 ℃低温保存。

1.3.3 UPLC分离待测样品

参考Frerot等[16]的UPLC分离条件并稍作修改。分离柱为C18柱（2.1 mm×100 mm，2.2 μm）；流动相A：0.1%甲酸溶液；流动相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；进样量：3 μL。梯度洗脱条件如表2所示。

表2 UPLC的梯度洗脱条件Table 2 Gradient elution conditions for ultra-high performance liquid chromatography

1.3.4 质谱鉴定呈味肽

酱油样品经UPLC分离后，分流通过电喷雾界面，进入高分辨质谱仪。采用电喷雾电离正离子扫描模式，质量扫描范围m/z 50～1 000。采用高纯度氮气作为雾化气和干燥气，干燥温度180 ℃，干燥气流速4.0 L/min。依据从头测序法和自动数据搜索法，对质谱结果进行离子碎片解析，从而推导出m/z 50～1 000多肽的氨基酸序列。

1.3.5 定向合成呈味肽

经1.3.1～1.3.3节分离且鉴定出目标呈味肽，由上海强耀生物科技有限公司进行定向合成，合成的呈味肽纯度均在95%以上。

1.3.6 呈味肽的基本感官呈味分析

采用定量描述分析[17]方法。参照GB/T 16291.1—2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分：优选评价员》的方法。男性7 名和女性5 名，年龄25～45 岁，在（23±2）℃的感官评价室进行。标准溶液为5 种，甜味（蔗糖，1 g/100 mL）、咸味（氯化钠，0.7 g/100 mL）、鲜味（谷氨酸钠，0.35 g/100 mL）、苦味（L-异亮氨酸，0.5 g/100 mL）、酸味（柠檬酸，0.08 g/100 mL）。合成多肽1 g/100 mL，感官评价采用九点线性标度法，0～9 分，分别表示无感觉、阈值感觉、感觉微弱、感觉中等、感觉强烈，绘制图表描述结果。

1.3.7 呈味肽的呈味阈值

合成呈味肽的阈值采用滋味稀释分析法[17]进行测定。合成呈味肽为1 g/100 mL，依据三角检验（1 个样品实验组，2 个空白对照组），按照1∶1逐步稀释。呈味肽的呈味阈值即为样品实验组刚好与另外2 个空白对照组（纯净水）区分的质量浓度，对各个感官品评员的结果取平均值。

1.3.8 呈味肽对酱油呈味的影响

空白对照组样品为海天味业市售酱油，pH 4.75，氨态氮质量浓度1.2 g/100 mL，评分为5 分。将合成呈味肽添加至空白对照组酱油溶液中，其质量浓度为0.03 g/100 mL，评价其感官效果。

1.4 数据处理

实验均重复3 次，使用OriginPro 9.0、Excel 2016和SPSS 16.0软件对数据进行处理，并绘制成相应的图表。

2 结果与分析

2.1 不同酱油pH值的变化规律

自然pH值和调控pH值酱油酿造过程中pH值的变化如图1所示。酱醪发酵过程中，调控pH值酱醪的pH值始终维持在6.5左右，自然pH值酱醪的pH值呈现不断下降的变化趋势。酱醪发酵过程中，自然pH值酱醪的pH值一直降低，可能是由于微生物生长代谢及其酶系进行的复杂生化反应，如乳酸菌生长可利用葡萄糖和柠檬酸产生乳酸和乙酸，从而降低酱醪pH值。

调控pH值酱醪的发酵过程中，pH值处于中性和弱酸性，可以充分发挥米曲霉分泌的谷氨酰胺酶、中性蛋白酶的作用，对原料的蛋白质进行分解，从而提高氨基酸、总氮的生成率，增加酱油中小分子肽含量，达到提升酱油感官滋味的目的[18]。调控酱醪pH值可以明显改变酱醪的pH值环境，最终影响酱油的质量。余自琳等[19]在pH 5.0～7.0反应条件下对墨鱼进行酶解，随着pH值升高，游离氨基酸总量升高，美拉德反应产物苦腥味减弱，鲜甜味突出。康乐等[20]研究了pH 5.0～6.5对牛肉酶解物美拉德风味特性的影响，发现随着pH值的增加，大分子肽段含量降低，小分子肽段含量上升，醇厚感显著增加，说明pH值的增大使肽类降解速率加快。

图1 不同酿造工艺发酵90 d酱醪pH值的变化Fig. 1 Changes in pH during soy sauce moromi fermentation with and without pH adjustment for 90 days

2.2 SPE技术和UPLC-MS/MS分离鉴定酱油中的呈味肽

Oasis MAX是一种新颖的混合模式聚合物吸附剂，利用阴离子交换基团提取酸性化合物及其代谢产物。谷氨酸、天冬氨酸等属于酸性（鲜味）氨基酸，其侧链R基团为酸性基团（如COOH、SO3H），能够作为前体形成鲜味物质。含有如谷氨酸和天冬氨酸等鲜味氨基酸残基的寡肽，很可能具有显著的鲜味[21]；而分子质量小于1 kDa的γ-谷氨酰肽很可能为浓厚感肽，具有鲜味和轻微酸味[22-23]。因此，这些物质很可能存在于呈酸性组分中。结合UPLC-MS/MS技术，分离鉴定酱油酸性组分中呈味肽的氨基酸序列，见表3、4。

结果表明，调控pH值和自然pH值酱油，多以小分子肽为主，经过Oasis MAX SPE柱提取后，酸性组分中所鉴定出的多肽均以含有酸性氨基酸Glu和Asp的小肽为主，如EM、ED、EE、EDD、EF、LDP、ESAY、AELY、FLET等。此外，在调控pH值和自然pH值酱油中均鉴定出ED、EE、EDD、SV、EF、FLET、LLVVQ和ALVLL，表明酱油的发酵原料及工艺流程对呈味肽的种类也具有一定的影响。

在这些鉴定出的呈味肽中，部分已经被报道具有较好的呈味效果，如Glu-Glu具有显著的鲜味，口感丰富；而Glu-Phe稍有涩味，口感丰富[24-25]；QLLN、LLVVQ、ESAY、AELY、FLET、FLTW、ALVLL和QVELF为首次在酱油中鉴定出来。因此，需要定向合成这些从酱油出鉴定出来的呈味肽，对其进行基本感官呈味分析和描述性评价系列实验，以进一步验证这些呈味肽的呈味效果及其鲜味增强作用、食盐的增强效应、酱油的增效作用。

表3 调控pH值发酵的酱油中呈味肽的氨基酸序列Table 3 Amino acid sequences of peptides in soy sauce fermented with pH adjustment

表4 自然pH值发酵的酱油中呈味肽的氨基酸序列Table 4 Amino acid sequences of peptides in soy sauce fermented without pH adjustment

2.3 呈味肽的呈味阈值及其特性

从表5可知，调控酱醪pH值发酵的酱油中获得的大部分呈味肽呈酸、鲜味，这是由于实验采用阴离子交换基团SPE柱对酱油中的酸性组分进行提取，仅小部分呈绵长的苦厚味。含有谷氨酸、谷氨酰胺残基的多肽中，大部分具有较低的呈味阈值，如ED、EE、EF、ESAY、AELY、FLET阈值为500 mg/L，除FLET外，均表现出明显的鲜味和酸味，口感丰富，ESAY还有利于浓厚感的延长；EM、EDD、QLLN、LLVVQ的阈值较高，为1 000 mg/L，除LLVVQ具有苦厚味外，均表现出较明显的鲜味；QNM的阈值最高，为2 000 mg/L，带有酸涩味。此外，含有缬氨酸残基的多肽，如SV、LLVVQ、ALVLL，均具有较突出的厚味。LLVVQ、FLET、FLTW、ALVLL中含有较多的苦味氨基酸残基，因而表现出较明显的苦味。

表5 合成呈味肽的呈味阈值及特性Table 5 Flavor threshold values and characteristics of synthetic peptides from soy sauces fermented with and without pH adjustment

自然酱醪pH值发酵的酱油中合成多肽的呈味阈值和特性见表5，其中ED、EE、EDD、SV、EF、LLVVQ、FLET、ALVLL已在调控pH值酱油中鉴定出，这表明不同发酵工艺对酱油成品中呈味肽的组成和含量具有一定的影响。其中NVP、LDP、LL、QVELF和QVELF均包含脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等苦味氨基酸的残基，因而表现出较为明显的苦味。

结果表明，自然pH值酱油发酵过程中，pH值不断降低，谷氨酰胺酶、蛋白酶等活性不断降低，谷氨酰胺在非酶作用下主要转化为无味或微酸的焦谷氨酸，从而导致酱油中的呈味肽均呈现较为明显的苦味。调控pH值酱油在发酵过程中，谷氨酰胺酶及中性蛋白酶活力较高，蛋白质被主要分解成小分子肽，如谷氨酰肽等，从而使酱油鲜味有所改善。

2.4 呈味肽对酱油的呈味影响

依据表3、4，选择离子响应强度较大的呈味肽，以0.03 g/100 mL添加至酱油中，分析其对酱油滋味的影响，结果见表6。

由表6可见，添加的ESAY使酱油厚味显著提高，风味得到明显改善；QLLN的增鲜效果显著；LLVVQ、AELY、FLET均对酱油鲜味稍有增强；FLTW、ALVLL的添加未对酱油产生明显感官变化。SV的添加使酱油浓厚感突出，风味显著提高；QVELF、ALVLL对酱油的感官效果无明显影响。

表6 酱油合成呈味肽与酱油的呈味效果Table 6 Effects of adding synthetic flavor peptides on the taste of soy sauces fermented with and without pH adjustment

本实验从两种不同酿造工艺的酱油中分离鉴定出多种小分子肽，主要为二肽、三肽、四肽等，呈味肽的呈味效果与分子质量以及其含有的氨基酸残基种类有关。Rhyu等[26]对大豆提取液中的小分子肽进行研究，结果发现分子质量为500～1 000 Da的酸性肽具有最强的鲜味，且结合型谷氨酸和天冬氨酸为鲜味的主要来源。Zhang Jianan等[27]对花生分离蛋白水解物进行分离鉴定，得到6 种新的呈味肽DQR、NNP、EGF、EDG、TESSSE，其中RGENESEEEGAIVT是第1个发现的具有鲜味及鲜味增强能力的十四肽。赵阳等[28]从紫贻贝蛋白酶解液中分离纯化出的六肽CSVQDQ或QAVNFT，具有明显的鲜味。Glu、Gln、Asp、Asn之间相互结合形成的多肽或它们与其他氨基酸形成的多肽，通常具有鲜味或厚味，Feng Tao等[29]从双孢蘑菇中分离出浓厚感肽GLPD和GHGD，具有显著的厚味。Liu Jianbin等[30]从酵母抽提物中鉴定出浓厚感肽EV，添加到鸡汤中，能够协调各种味觉。在本实验鉴定出的呈味肽中，ED、EE、EF、ESAY、AELY、FLET呈现出突出的鲜味，而EM、EDD、QLLN有较强的鲜味。含有Val残基的多通常具有显著的浓厚感，本实验鉴定出的SV、LLVVQ、ALVLL具有较强的厚味，其中SV厚味阈值最低。

3 结 论

Oasis MAX混合型阴离子SPE柱对富集酱油中含谷氨酸或天冬氨酸的呈味肽有较好的效果。

从调控pH值发酵的酱油中鉴定出14 种呈味肽，从自然pH值发酵的酱油中鉴定出12 种呈味肽，其中8 种呈味肽（ED、EE、EDD、SV、EF、LLVVQ、FLET、ALVLL）在两种酱油中均鉴定出。QLLN、LLVVQ、ESAY、AELY、FLET、FLTW、ALVLL和QVELF首次在酱油中鉴定出。

调控pH值发酵的酱油中ED、EE、EF、ESAY、AELY、FLET阈值最低，为500 mg/L，除FLET外，其他均表现出明显的鲜味和酸味，口感丰富，ESAY还有利于厚味的延长；SV厚味阈值最低，为500 mg/L。自然pH值发酵的酱油中，SV、LLVVQ、ALVLL具有突出厚味；LLVVQ、FLET、FLTW、ALVLL含有较多的苦味氨基酸残基，因而表现出较明显的苦味。

定向合成QLLN、LLVVQ、ESAY、AELY、FLET、FLTW、ALVLL、QVELF、SV，并以0.03 g/100 mL添加到市售酱油中，发现ESAY显著降低酱油咸味，提高酱油厚味；QLLN增鲜效果显著；LLVVQ、AELY、FLET增鲜效果较为显著；SV的添加使酱油浓厚感突出，风味显著提高。结果表明，调控pH值发酵的酱油中含有较多良好呈味效果的小分子肽，使酱油具有更突出的鲜味和厚味，丰富协调酱油的口感。