PCR 快速检测坚果及籽类制品中的霉菌

袁爱华 ，骆瑜 ，王维亚 ，林志超

（1.南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330096；2.南昌市食品安全检测与控制重点实验室, 江西 南昌 330096）

坚果及籽类制品包含品种多达20 多种，其口味独特，营养价值丰富，含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、微量元素、膳食纤维和多种不饱和脂肪酸。该类产品具有抗氧化、软化血管、抑制肥胖和降低糖尿病发病率等作用[1,2]。随着人们生活条件的改善和保健意识的提升,对坚果与籽类制品的需求量日见增长。但坚果与籽类制品在生产、储存及运输时极易受到霉菌的污染,食品的深加工和网购的流行，更让产品质量难以保证。欧盟食品和饲料快速警报系统（RASFF）的报告数据显示，真菌毒素是坚果和籽类食品中报告频率最高的有害物质[3,4]。真菌毒素是霉菌产生的有害次生代谢产物[5]，食源性霉菌已成为食品安全风险的重要来源之一。霉菌的检测主要有传统培养法、生化检测法、代谢学检测法、流式细胞技术法、实时光电微生物检测法及分子生物学检测法等[6]。传统培养法作为国标金标准，存在检测时间长、操作复杂及工作量大的缺点。随着现代科学技术的发展和对监管时限要求的提高, 快速高效的检测方法逐渐受到广泛关注。PCR 检测技术以其快速、简便、准确等优点在国际上得到了广泛的认可[7]，被誉为现代快速方法的金标准。在霉菌检测方面，预计PCR 检测比传统培养方法快4～6d。由于霉菌PCR 检测技术起步较晚，加之霉菌生理和形态的多样化和复杂性，及食品成分的基质效应也可能影响菌体生长和PCR 扩增[8],致使霉菌PCR 检测技术应用并不广泛。黑曲霉菌是增菌培养基的霉菌质控菌珠,黄曲霉菌和青霉菌是农产品贮存过程中出现的主要致腐菌[9-12]。为提高坚果及籽类制品中霉菌的检测时效,本研究以黑曲霉、青霉菌、黄曲霉菌为实验菌珠,通过改良前增菌培养，优化扩增条件，建立适用于坚果及籽类制品的霉菌PCR 检测技术, 同时对本市抽样的检品进行检测, 并与传统分离培养法进行对比研究，确认方法学的适用性和有效性，实现对坚果及籽类制品中霉菌的快速检测。

1 材料与方法

1.1 实验材料 黑曲霉菌珠 CMCC（F）98003（定量1000～2000 CFU/颗,购自北京三药科技开发公司），黄曲霉菌、青霉菌为本实验室保存；花生仁、葵花子、瓜子、核桃、花生等为超市自购；68 批检品为2019 年抽样样品。

1.2 仪器与试剂 西班牙BioII-Advance4 生物安全柜、上海一恒THZ－100 恒温培养摇床、HIRYAM AHVA-85 高压蒸汽灭菌锅、 尼康XS212 显微镜、杜邦BAX SystemQ7 全自动病原微生物检测系统、法国Interscience BagMixer400s 均质器、 北京六一生物科技DYY-6C 型电泳仪、 上海勤翔科学仪器1880 凝胶成像系统。酪蛋白葡萄糖肉汤、马铃薯液体培养基（含氯霉素）、察氏液体培养基、麦芽汁培养基、麦芽浸粉、马铃薯葡萄糖琼脂培养基( PDA)均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，孟加拉红购自北京陆桥技术有限责任公司，马铃薯汁（自制，取去皮马铃薯200 g 切成小块，加水1000ml，煮沸 20min，纱布过滤，备用）。杜邦霉菌检测试剂盒购自Hygiena LLC。氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁，均为化学纯或分析纯。

1.3 改良培养基的配置 改良酪蛋白葡萄糖肉汤配方：酪蛋白葡萄糖肉汤加马铃薯（200g/1000ml）（简称酪改），改良麦芽汁培养基配方：麦芽汁培养基加氯化钠5g/1000ml（简称麦改），改良马铃薯液体培养基配方：马铃薯液体培养基加磷酸氢二钾1 g/1000ml、 硫酸镁 0.5g/1000ml、 氯化钾 0.5g/1000 ml、硫酸亚铁 0.01g/1000ml（简称马改），改良察氏液体培养基配方：察氏液体培养基加马铃薯（200g/1000ml）（简称察改），以上培养基高压灭菌后按每管1ml 分装于带分裂珠的分裂管， 所有培养基均为新鲜配制。

1.4 试验方法

1.4.1 菌悬液的制备 将定量黑曲霉菌株用配套菌株复溶液活化后以0.9%无菌氯化钠溶液稀释，用移液器充分吹打使孢子呈均匀分散状态,采用血球计数板对孢子计数后进行梯度稀释,使孢子悬液浓度约为 100 CFU/ml、200 CFU/ml 备用。黄曲霉菌、青霉菌以0.9%无菌氯化钠溶液制备后与黑曲霉菌混匀，同方法进行梯度稀释，使混合孢子悬液浓度约为 100 CFU/ml、200 CFU/ml 备用。

1.4.2 前增菌的优化 对5 种霉菌常用基础培养基进行改良，以相互缺少成分为变量，分别按组合排列方式添加至原培养基中, 得到改良培养基共51种, 通过对30 h 内黑曲霉菌肉眼可见菌丝球的培养基进行36 h 干质量对比和形态分析, 筛选出适合霉菌快速增菌的优势改良培养基：酪改、麦改、察改、马改[13]，并对此4 种优势改良培养基进行坚果及籽类制品中霉菌的PCR 检测。

1.4.3 PCR 体系的优化 通过预实验观察食品基质加入培养基的状态发现，花生仁、核桃仁等脂质含量高和出浆高的坚果与籽类易使培养基浑浊，易造成检测结果假阴性，为减少基质对DNA 的提取和PCR 扩增的影响,样品均质后应静止5min 后取上清液作增菌培养。DNA 提取液和PCR 引物及反应体系均使用杜邦BAX system 霉菌试剂盒组分及方案。确定 PCR 反应条件：94 ℃预变性 2min，1个循环；保持退火温度56 ℃ 45S，72 ℃延伸120S，共扩增38 个循环,可减少非特异性产物的形成，用杜邦BAX SystemQ7 扩增并读取结果后，将扩增产物在1 .50 %琼脂糖凝胶电泳上分离验证。

1.4.4 敏感性实验 通过预实验后, 对人工污染样品检测限度进行确认。取黑曲霉菌及混合备用孢子悬液按10 倍比例分别对经检测无菌的花生仁进行人工污染,使各霉菌悬液在花生仁中的含量分别约为10 CFU/g、20 CFU/g。黑曲霉菌和混合霉菌污染的花生仁各取10g 放置到90ml 0.9%无菌氯化钠溶液稀释, 均质器拍打30 S 制成均匀的悬混液备检。各取 200μl 悬混液至 1ml 酪改、 马改、麦改、察改分裂管中增菌,28 ℃、160r/min 恒温培养摇床培养26h 增菌。增菌液按杜邦BAX 霉菌试剂盒说明进行DNA 的核酸提取,取50μL 裂解物按优化后的扩增条件进行扩增读取结果，建立PCR 方法。同时,对以上各样品按国家标准GB4789.15-2016[14]霉菌的培养方法各取1ml 至平皿(n=2)进行验证。

1.4.5 样品前处理的影响 因GB19300-2014《食品安全国家标准坚果与籽类食品》[15]中仅对过氧化值和酸价的检测明确了样品前处理方式,对霉菌的检测未明确样品前处理方式。考虑嗑食和剥食的食用方式与外壳的接触程度,及坚果类食品的外壳前处理方式对霉菌检测结果的影响,分别选取可嗑食的葵花子、瓜子各1 份和剥食的核桃、花生各2 份置80%湿度环境，暴露受潮20 d，对以上样品进行去壳和不去壳处理后， 常规取样均质器拍击后用已建立的PCR 和传统培养法（n=2)进行检测与验证。

1.4.6 实际样品检测 对68 份日常监督抽样样品进行PCR 检测与传统培养法验证。各取10g 放置到90ml0.9%无菌氯化钠溶液稀释,均质器拍打30S制成均匀的悬混液备检。各取200μl 备检悬混液,放置到1ml 酪改、马改、察改分裂管中增菌，28℃、160r/min 恒温培养摇床培养26h 后按PCR 法进行检测。同时,对以上各样品按国家标准GB 4789.15～2016[14]霉菌的培养方法进行检验验证。

1.4.7 数据处理 采用SPSS20.0 软件进行分析,以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 敏感性实验 由图1 可知,杜邦BAX SystemQ7检测结果除空白阴性外，麦2 结果也是阴性，说明麦2 未检出；从电泳图可以发现所有内标阳性和检测结果条带清晰，未见其它非特异性扩增产物，检测项目除麦2 和空白阴性外, 其它检测结果均阳性,与杜邦BAX SystemQ7 检测结果一致。对以上污染样品用孟加拉红培养5d 计数，黑曲霉菌液分别为 9 CFU/g、20 CFU/g，混合菌液分别为 10 CFU/g、18 CFU/g。由以上结果可知，除在麦芽汁改良培养基26h 增菌，检测结果不稳定外，酪改、马改、察改对于黑曲霉菌及混合霉菌污染样的检测限度均能达到10 CFU/g,检测限度优于试剂盒原非合并样品检测法；和杜邦BAXsystem 中针对酸奶、玉米粉和婴儿配方奶粉中酵母菌和霉菌的检测时间对比，检测时效缩短18h。考虑改良麦芽汁培养基在10 CFU/g 检测限度时不稳定，故只用酪改、马改、察改作前增菌培养基进行实际样品验证。

图1 人工污染样品敏感性实验结果

2.2 样品前处理的影响 霉菌菌丝虽有可穿透食品的物理三维空间性质，但由检测结果可知，核桃的霉菌PCR 检测结果, 未去壳的核桃四种增菌液中检测均阴性,而去壳的核桃四种增菌液中检测结果均为阳性,对照培养法的结果可见未去壳核桃中霉菌结果分别为7 CFU/g、5 CFU/g，去壳核桃中霉菌结果分别为11 CFU/g、13 CFU/g。未去壳的花生和去壳的花生四种增菌液中PCR 检测结果均为阳性,对照培养法的结果可见未去壳花生中霉菌结果分别为22 CFU/g、35 CFU/g，去壳花生中霉菌结果为 29 CFU/g、39 CFU/g。未去壳核桃、花生与去壳核桃、花生培养法结果均有显著性差异，说明去壳后检测结果更具代表性。这与花生和核桃类坚果易从可食部分滋生霉菌有关,也与此类坚果外壳厚重而营养缺乏,霉菌滋生速度较慢但占取样比重较大,而造成去壳和未去壳前处理方式对检测结果影响较大。嗑食类的未去壳和去壳的葵花籽和瓜子四种增菌液中霉菌PCR 检测均阴性, 对照培养法的结果可见葵花籽未去壳的结果1 CFU/g, 去壳后结果为＜1 CFU/g,未去壳和去壳的瓜子结果均为＜1 CFU/g，结果无显著性差异。葵花籽和瓜子等籽类主要食用方式为嗑食，易食用到外壳污染菌，而剥食类与外壳相对接触少,因此建议坚果及籽类制品中对微生物的检测也应该明确剥食类带壳坚果应剥去外壳，再取样检测。

2.3 实际样品检测 检测结果表明，PCR 检出5 份,检出率为7.35%；培养法检出8 份,检出率为11.76%,共有3 批结果低于10 CFU/g,所以PCR 未检出，按培养法可判定1 例不合格, 不合格率为1.47%。说明PCR 实验的敏感性和特异性符合方法学预期，可作为快速检测方法。

3 讨论

由于霉菌孢子可以在空气中长时间存活，并可通过空气传播给其他物质，因此它们无处不在。霉菌污染产生的真菌毒素给人们的生活和健康带来了极大的危害,其污染造成的损失一直是人们关注的焦点。近年来，世界上许多国家都制定了各种食品中霉菌的限量标准，同时，为加强对霉菌检测技术的研究, 不断提出改进检测技术的新思路。PCR 技术是对特定DNA 片段的扩增，在食源性微生物检测中起着重要作用。本实验通过改良前增菌时间和优化扩增条件,研究坚果及籽类制品的基质效应对霉菌PCR 检测的影响, 优化建立适用于坚果及籽类制品的PCR 检测方法。该检测方案较杜邦BAXsystem 中针对酸奶、 玉米粉和婴儿配方奶粉中酵母菌和霉菌的检测方案时间缩短18h，检测限可达10 CFU/g。经验证，敏感性和特异性满足坚果及籽类制品中霉菌限量检测要求。因PCR 检测不能判断病原菌的死活状态，且无法定量，不能直接举证病原菌的感染力,因而不能作为公共卫生突发事件的病原学诊断依据和食品检测限量标准的判定依据, 故有待对实时定量PCR 检测方法作进一步研究。鉴于上述情况，建议在实际工作中和公共安全应急检验及对坚果及籽类制品原材料大批量筛选时, 将PCR 法和传统培养法结合起来使用。根据PCR 最低检测限可以筛出批量检品中霉菌含量可能存在不合格的批次,对疑似不合格样品进行培养确定，从而达到快速精准的检测目的。

坚果及籽类制品在采摘、晾晒干燥等处理过程及保藏运输过程中都可能受到霉菌的侵染[16]。散装、非品牌、流通市场坚果不合格率不容乐观[17,18]，与本实验室近年监督抽检结果一致。一些不法商贩为了盈利不惜违法以霉变原料经处理后加工销售，经处理后的坚果及籽类制品外表无眼观变化，但果肉可能霉菌量很高或变质。为反映检测结果的客观真实性，建议对剥食类带壳坚果剥去外壳，再取样检测。