循环长链非编码RNA 作为生物标记物用于结直肠癌诊断的meta 分析

江梅，万腊根，万劲华，聂益军，刘淑媛，吕小林，张长林

（南昌大学第一附属医院检验科，江西 南 昌 3 30006）

结直肠癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，每年有超过60 万人因结直肠癌死亡[1]。若结直肠癌能够早期发现和诊断,结直肠癌相关的死亡可明显降低。结直肠癌I 期患者5 年生存率可达93%,II 期患者也超过80%, 而晚期患者少于10%[2,3]。由于早期结直肠癌患者没有明显的临床症状，所以多数患者在确诊时已经是晚期。目前常用的早期诊断技术有结肠镜、大便隐血试验、大便DNA检测以及肿瘤标志物检测。结肠镜检查被认为是目前结直肠癌诊断的 “金标准”,但其有创、花费高、有医疗风险等特点限制其在结直肠癌筛查中应用。大便隐血试验由于无创、花费少、取材方便的特点被广泛地运用到结直肠癌的筛查中,但其灵敏度低,且取材前需要苛刻的饮食控制。大便DNA 检测由于样本处理过程繁琐以及花费高等特点限制其在结直肠癌中的广泛运用[4]。肿瘤标志物CEA 以及CA199 诊断结直肠癌的灵敏度和特异度也不理想[5]。因此，仍迫切需要寻找可用于结直肠癌早期诊断的新方法。

长链非编码RNA (long non-protein coding RNA，lncRNA)是在真核生物中新发现的一类长度大于200 个核苷酸,不具备蛋白编码能力的非编码RNA。越来越多的证据表明lncRNA 在肿瘤细胞增殖，凋亡，浸润以及转移起重要作用[6-8]。近年来，许多研究证实lncRNA 可作为生物标记物用于结直肠癌的诊断[9-17]。但这些研究结果中lncRNA 的诊断效能并不完全一致，因此本研究利用 Meta 分析的方法，对lncRNA 在结直肠癌中的诊断价值进行系统性评价。

1 材料与方法

1.1 检索策略 两名研究人员独立检索英文数据库PubMed, Embase 以及OVIDSP, 检索截止日期2018 年 10 月 1 日。英文数据库主要检索词为(‘Lo ng Noncoding RNA’ OR ‘LncRNA’ OR ‘Long ncRNA’ OR ‘Long Non-Translated RNA’ OR ‘Lo ng Nontranslated RNA’ OR ‘Long Non-Coding RN A’ OR ‘Long Non-Protein-Coding RNA’ OR ‘Lo ng Untranslated RNA’ OR ‘Long ncRNAs’ OR ‘Lo ng Intergenic Non-Protein Coding RNA’ OR ‘LincRNAs’ OR ‘LINC RNA’ OR ‘Long Non Protein Coding RNA’) AND (‘circulating’ OR ‘serum’ OR‘sera’ OR ‘blood’ OR ‘plasma’)AND (‘colorectal’OR ‘colon’ OR ‘colonic’ OR ‘rectal’ OR ‘rectum’) AND (‘cancer’ OR ‘carcinoma’ OR ‘tumor’OR ‘neoplasm’)。此外，对原文及综述所列出的参考文献进行手工检索。

1.2 文献纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 ⑴结直肠癌患者均经结肠镜或病理组织学确诊；⑵明确给出IncRNA 诊断的灵敏度和特异度,或通过间接计算能够得到诊断试验四格表数据；⑶研究的样本类型为血浆或血清；⑷国籍和种族不限，发表语种为英文。

1.2.2 排除标准 ⑴文献重复；⑵书信、会议报告、综述、评论和未经校对的论文；⑶无法计算出四格表数据或数据不全。

1.3 数据提取 文献提取信息包括第一作者姓名、发表时间、国家、病例组人数、对照组人数、样本类型、lncRNA 的检测方法、lncRNA 的名称，诊断性能指标主要包括曲线下面积 （Area under the curve，AUC）、灵敏度（Sensitivity，SEN）、特异度（Specificity，SPE）、真阳性（True positive，TP）、假阳性（False positive，FP）、假阴性（False negative，FN）以及真阴性（True negative，TN）。数据提取由两名研究人员分别独立完成，若两人提取结果不一致，则需共同研究后达成一致。

1.4 文献质量评价 纳入文献的质量评价参照Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies 2(QUADAS-2)[18]。QUADAS-2 是在 QUADAS 的基础上改进后用于诊断性试验的质量评价工具,由四个域组成（patient selection，index test，reference standard 以及 flow and timing）。前三个域的标志性问题按“high”、“unclear”、“low”评分以判断偏倚风险及适用性。

1.5 统计学分析 使用双变量随机效应模型合并灵敏度（SEN）、特异度（SPE）、阳性似然比（PLR）、阴性似然比（NLR）、诊断比值比（DOR）[19]，同时合并总的受试者工作特征曲线 （SROC） 并计算出曲线下面积（AUC）。异质性检验包括阈值效应检验和非阈值效应检验。阈值效应通过Spearman 相关系数和 SROC 曲线形态评价。若 SROC 曲线呈现“肩臂状”分布，则存在阈值效应；若 SROC 曲线不呈“肩臂状”分布且 Spearman 相关系数 P＞0.05，则不存在阈值效应。非阈值效应由 Cochran’s Q 检验和I2（inconsistency index ）检测,若 P＜0.05 或 I2＞50%提示存在非阈值效应。亚组分析和Meta 回归用于分析异质性原因。Deek’s 检验用于发表偏倚判断和评估[20]。所有数据采用Meta-Disc 和STATA 12.0软件进行统计分析[21]。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 文献检索结果以及纳入研究的基本特征 按标准筛选文献流程，最终纳入9 篇文献，其中包括17 项研究。文献的筛选流程见图1,纳入研究的基本特征见表1。文献共包括 833 例结直肠癌患者和688 例对照。8 篇文献的结直肠癌患者均经结肠镜或病理组织学确诊，1 篇文献未说明[14]，我们与作者联系后确认了该研究中的所有结直肠癌患者均经病理组织学确诊。因此，833 例结直肠癌患者均通过“金标准”确诊。文献的发表年限为2011 年至2017 年。其中以中国人为研究对象的文献有8 篇，以澳大利亚白人为研究对象的1 篇。5 篇文献的样本类型为血浆，其余4 篇文献的样本类型为血清。17 项研究中15 项是评价单一IncRNA 的诊断价值，1 项是评价联合三种IncRNAs 的诊断价值，1项是评价联合四种IncRNAs 的诊断价值。所有的研究都是采用定量PCR (quantitative PCR ,qPCR)方法检测。

图1 文献筛选流程

2.2 质量评价 纳入研究均采用QUADAS-2 进行质量评价。如图2A 以及2B 所示，主要的偏倚发生在“patient selection”，所有纳入文献的质量达到相对较高的水平。

2.3 循环lncRNAs 在结直肠癌中的诊断价值 图3A 以及3B 分别为lncRNA 诊断结直肠癌的合并SEN，合并SPE 的森林图。结果显示IncRNA 诊断结直肠癌的合并SEN、合并SPE、合并 PLR、合并NLR 以及合并 DOR 分别为 0.77 (95%CI：0.72～0.8 1)，0.83(95%CI：0.76～0.88)，4.5 (95%CI：3.2～6.4)，0.28 (95%CI：0.22～0.35)以及 16 (95%CI：9～27)。图4 为 SROC 曲线图，结果显示 AUC 为 0.86(95%CI：0.83～0.89)， 结果提示循环 lncRNA 在结直肠癌中的诊断价值较高。

表1 纳入研究的基本特征

图2 偏倚风险和适用性问题图(A)以及偏倚风险和适用性问题总结图(B)

2.4 异质性检验，Meta-回归以及亚组分析 阈值效应是导致异质性的重要原因之一,它是指诊断试验各研究间阳性结果和阴性结果判断标准存在差异所引起的异质性。Spearman 相关系数是分析阈值效应的一种有效方法[22,23]。在本研究中,Spearman相关系数为-0.287，P= 0.264 (P＞0.05)，提示不存在阈值效应。SROC 曲线未呈现肩臂状效应，进一步说明纳入研究不存在阈值效应。采用Cochran’s Q检验和I2 检验分析有无非阈值效应，结果显示，灵敏度I2、特异度I2、阳性似然比I2、阴性似然比I2、诊断比值比I2 分别为80.61%(P=0.00),85.22%(P=0.00),81.25%(P=0.00),86.00%(P=0.00) 以及100%(P=0.00)，提示存在显著非阈值效应。为进一步寻找引起异质性的原因，根据样本量(＞60 vs≤60)、种族(亚洲人 vs 白人)、IncRNA 研究模式(联合 vs 单一)、样本类型(血浆vs 血清)做亚组分析，结果显示异质性主要来源于样本量以及样本类型， 样本量≤60组的特异度优于样本量＞60 组(0.87vs0.81)，样本类型为血浆组的灵敏度优于血清组（0.79vs0.74）。见图 5、表 2。

图3 循环lncRNAs 诊断结直肠癌的合并灵敏度(A)，合并特异度(B)的森林图

图4 循环lncRNAs 诊断结直肠癌的SROC 曲线

2.5 发表偏倚 Deek’s 检验用于发表偏倚判断和评估。P 值为0.80，提示各研究间不存在发表偏倚,见图6。

3 讨论

表2 循环lncRNAs 诊断结直肠癌亚组分析的灵敏度和特异度

图5 循环lncRNAs 诊断结直肠癌亚组分析的灵敏度和特异度

近年来，有不少研究报道lncRNA 在肿瘤细胞增殖，凋亡，浸润以及转移发挥重要作用[6-8]。并且，lncRNAs 不仅在肿瘤组织扮演重要角色，而且可作为循环标记物用于肿瘤诊断，如结直肠癌的诊断[9-17]。然而，它们的诊断效能仍不明确。目前国内外未见关于循环IncRNA 在结直肠癌中诊断价值的系统性评价。本研究利用 Meta 分析的方法，对循环lncRNA 在结直肠癌中的诊断效能进行综合评价。

图6 Deek’s 检验用于发表偏倚判断和评估

在本研究中,纳入的9 篇文献共包括 833 例结直肠癌患者和688 例对照。使用双变量随机效应模型合并 SEN、SPE、PLR、NLR、DOR 分别为 0.77(95%CI：0.72 ～0.81)，0.83 (95%CI：0.76 ～0.88)，4.5(95%CI：3.2～6.4)，0.28 (95%CI：0.22～0.35)以及 16(95%CI：9～27)。SROC 曲线 图显 示 AUC 为 0.86(95%CI：0.83～0.89)。有文献报道[24],CEA 以及 CA1 99 诊断结直肠癌的灵敏度仅仅为11.1%和7.7%，Wang J 等研究结果显示CEA 以及CA199 诊断结直肠癌的 AUC 值也仅为 0.649 以及 0.598[25]。循环miRNAs 作为一种新的血液标记物，在结直肠癌诊断中也有相对较高的诊断价值，灵敏度，特异度以及 AUC 值分别为 78% 、79%、 0.87[26]。我们研究发现lncRNAs 的诊断效能与miRNAs 相似, 但是与lncRNAs 相比，miRNAs 的逆转录过程更为繁琐耗时。因此，我们得出结论与其它无创性血液标记物相比,有着高灵敏度以及特异度的循环lncRNAs 在诊断结直肠癌中更为优越。诊断结直肠癌的阳性似然比PLR 以及阴性似然比NLR 为4.5 (95%CI：3.2～6.4),0.28(95%CI：0.22～0.35),结果提示循坏 lnc RNAs 确诊或排除结直肠癌的能力相对较弱。DOR作为一个综合诊断指标, 其值在0 至无限大之间[27]，DOR=1 提示该检测不能很好地将结直肠癌患者组和对照组区别开。DOR 值越高，检测的诊断效能越好。在本研究中,DOR 为16,结果提示循环lnc RNAs 作为潜在的生物学标记物在结直肠癌中的诊断价值较高。

总的来说,异质性主要来源于阈值效应以及非阈值效应。幸运的是，本研究中的异质性并非来自阈值效应，而是来源于非阈值效应。为进一步寻找引起异质性的原因，根据样本量(＞60 vs≤60)、种族(亚洲人 vs 白人)、IncRNA 研究模式(联合 vs 单一)、样本类型(血浆vs 血清)做亚组分析，结果显示异质性主要来源于样本量以及样本类型, 样本量≤60组的特异度优于样本量＞60 组(0.87vs0.81)。纳入研究的结直肠癌患者数量是在15 至220 之间，样本量的差异可能导致异质性。为了增加研究数量，我们对样本量没有严格的标准。另外，样本类型为血浆组的灵敏度优于血清组（0.79vs0.74）。血浆除含有凝血因子以外，其它成分基本与血清相同。在诊断性试验中，血浆和血清都是常见的样本类型，血浆或血清在循环lncRNAs 的检测中哪一个更优越尚不明确。因此，仍然需要进一步的研究证实循环lncRNAs 的检测与样本类型相关。本研究结果显示种族或IncRNA 研究模式的差异并不会导致异质性，这与以往的研究发现IncRNA 的联合检测诊断价值更高的结论不一致[16]。而在本次系统性评价中,只有两篇文献是IncRNA 的联合检测，纳入的研究数量较少。因此，仍然需要进一步的研究证实IncRNA 联合检测的诊断价值。

尽管本研究结果显示循环lncRNAs 可作为潜在的生物标记物用于结直肠癌的诊断,但仍存在一些局限性。第一，纳入的研究数量相对较少，仍需更多的研究才能给出肯定性的结论。第二,本研究存在一些偏倚, 所有纳入的研究都为病例对照研究,另外,大多数纳入的研究对于是否是连续性样本还是随机样本以及研究是否避免了不恰当的排除没有明确说明，这些都导致了文献质量评价‘patient selection’域偏倚为高风险，进一步的研究需要避免这些偏倚。第三，纳入的研究中除了一项研究来自澳大利亚其余都来自中国，因此，纳入研究的患者大多数都是亚洲人。白种人以及非洲人的研究也是必不可少的。

综上所述， 循环IncRNAs 对结直肠癌具有较高的诊断价值， 可作为结直肠癌诊断的潜在生物标记物。但仍需要进一步大样本的研究来证实我们的结论。