NLRP3炎症小体在迷迭香酸促进鼻咽癌细胞凋亡中的作用

赵 琳,巩 楠

(西安医学院第一附属医院耳鼻喉科,西安 710077;*通讯作者,E-mail:1906974438@qq.com)

鼻咽癌是我国南部常见的恶性肿瘤之一,发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。因其原发部位较为隐蔽,疾病早期不易被发现,故多数患者确诊时已属中晚期,并大多伴有远处转移。目前鼻咽癌最有效的治疗手段是放疗和化疗结合治疗,但由于非靶向性和非特异性,放化疗的毒副作用可严重影响治疗效果,并导致许多后遗症[1,2]。因此寻找疗效好、毒副作用低的药物对提高患者生活质量很有必要。近年来天然植物抗肿瘤药物因其低毒性、高利用度等特点已成为肿瘤治疗的研究热点[3,4]。

迷迭香酸(rosrarinicacid,RA)是迷迭香的主要化学成分之一,是一种天然水溶性的多酚羟基化合物,广泛分布于唇形科、葫芦科、紫草科等植物中[5]。目前医学研究发现,RA具有广泛的药理活性,如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫调节抗菌和抗病毒等多种作用[6,7]。已有研究证实RA对鼻咽癌细胞增殖发挥抑制作用,但其机制尚需深入研究[8]。已有研究表明鼻咽癌的发生发展与炎症反应密切相关[9],而NLRP3是目前研究较多且深入的炎症小体,但关于NLRP3炎症小体与鼻咽癌相关性的研究却较少。此外,对于RA在鼻咽癌中发挥抗肿瘤作用与NLRP3炎症小体的关系鲜有报道。本研究以CNE-1细胞为对象,观察RA对其增殖和凋亡的影响,探讨NLRP3炎症小体在其中的作用,为以NLRP3炎症小体为新靶点用于鼻咽癌的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

RA(上海恒斐生物科技有限公司),CNE-1细胞(武汉巴菲尔生物技术服务有限公司),10%小牛血清(Gibco公司),胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液(碧云天公司),RPMI-1640培养基(Gibco公司),CCK-8试剂盒(Sigma公司),Annexin Ⅴ-PE/7-AAD流式试剂盒(BD公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司),兔多抗NLRP3(118KD,美国Novus公司),兔单抗ASC(22KD,英国Abcam公司),兔单抗pro Caspase-1+p10+p12(35/45 kD,英国Abcam公司),兔多抗GAPDH(37 kD,杭州贤至生物有限公司),辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 细胞培养

将CNE-1细胞复苏后,置于37 ℃、5% CO2孵箱内培养。其中RPMI-1640培养基内含10%胎牛血清,青霉素100 U/ml和链霉素100 μg/ml。每2-3 d传代换液1次,取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 CCK-8检测细胞增殖

将处于对数生长期的细胞胰酶消化后,计数调整细胞浓度至5×104个/ml,将细胞均匀的接种到96孔板中,每孔100 μl,每组细胞设3个复孔,同时设置空白对照孔,周围孔加入100 μl PBS,将96孔板移入培养箱中培养过夜。分别加0,20,40,80 μmol/L RA处理,37 ℃、5%CO2饱条件培养48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃培养4 h,放至摇床低速振荡10 min,使用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度值A。细胞增殖率(%)=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

1.4 流式细胞术检测各组细胞凋亡

用6孔板培养细胞,待细胞生长达到60%-70%,根据上述实验分组处理细胞,继续培养48 h。收集细胞培养基上清和沉淀,2 000 r/min离心5 min;用PBS洗涤细胞2次,2 000 r/min离心5 min,收集1×105个细胞;在50 μl的Binding Buffer中加入5 μl 7-AAD染液,混匀;收集细胞中加入上述7-AAD染液,混匀;室温、避光、反应10 min;反应后再加入450 μl的Binding Buffer混匀;加入1 μl的Annexin Ⅴ-PE混匀;室温、避光、反应10 min;1 h内用流式细胞仪观察和检测细胞凋亡。

1.5 Western blot检测NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达

收集上述各组细胞,BCA法测定蛋白浓度,取50 μg等量蛋白上样,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜,封闭液室温封1 h,加入一抗NLRP3(1 ∶1 000),ASC(1 ∶10 000),Caspase-1(1 ∶1 000)、GADPH(1 ∶1 000)。4 ℃孵育过夜,加入辣根过氧化酶标记的二抗(1 ∶5 000),室温孵育2 h,凝胶成像分析系统扫描分析,以GAPDH为内参计算各组目的蛋白的相对表达水平。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 RA对CNE-1细胞增殖的影响

CCK-8结果显示,培养48 h时,对照组、20 μmol/L RA组、40 μmol/L RA组和80 μmol/L RA组细胞增殖率分别为99.97%±0.88%,88.92%±1.56%,75.09%±1.12%,53.77%±1.93%。与对照组相比,20,40,80 μmol/LRA组CNE-1细胞增殖均明显抑制(P<0.05),且随着RA浓度的增加,其抑制细胞增殖的效应也增强,各浓度组之间的差异具有统计学意义(均P<0.05,见图1)。

图1 RA对CNE-1细胞增殖的影响Figure 1 Effect of RA on proliferation of CNE-1 cells

2.2 RA对CNE-1细胞凋亡的影响

流式细胞检测细胞凋亡结果显示,0,20,40,80 μmol/L RA处理细胞48 h,各组细胞凋亡率明显上升,分别为2.82%±0.35%,6.31%±0.46%,14.01%±0.36%,24.34%±1.56%。与0 μmol/L相比,20,40,80 μmol/L的RA均能明显促进CNE-1细胞凋亡(均P<0.05),且随着RA浓度的增加,其促细胞凋亡效应也增强,各浓度组之间的差异具有统计学意义(均P<0.05,见图2)。

图2 RA对CNE-1细胞凋亡的影响Figure 2 Effect of RA on apoptosis of CNE-1 cells

2.3 RA对CNE-1细胞表达NLRP3炎症小体的影响

Western blot法检测各CNE-1细胞中NLRP3,ASC及Caspase-1蛋白的表达水平。结果显示,与0 μmol/L相比,20,40,80 μmol/L的RA均能明显抑制CNE-1细胞表达NLRP3,ASC及Caspase-1蛋白(均P<0.05),且随着RA浓度的增加,其抑制细胞表达NLRP3炎症小体的效应也增强,各浓度组之间的差异具有统计学意义(均P<0.05,见图3)。

与对照组相比,*P<0.05;与20μmol/L RA组相比,#P<0.05;与40μmol/L RA组相比,&P<0.05图3 RA对CNE-1细胞表达NLRP3,ASC及Caspase-1蛋白的影响Figure 3 Effect of RA on the expressions of NLRP3, ASC and Caspase-1 in CNE-1 cells

3 讨论

鼻咽癌是一种起源于鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤,其恶性程度高,容易发生远处转移,严重威胁人类生命健康[10]。鼻咽癌的分布具有明显的地域性,在世界范围内呈低发水平,但在我国是常见的恶性肿瘤之一,全世界80%的鼻咽癌患者发生在我国的华南地区[11]。目前鼻咽癌的治疗手段以放化疗为主,但经一线放化疗后仍难以避免出现疾病进展,出现复发转移患者的预后较差[12]。目前寻找放化疗中的辅助药物已经成为肿瘤领域研究的热点,因此寻找新的疗效好、无毒副作用的药物成为必然趋势。鼻咽癌的发病机制仍未完全阐明,一般认为鼻咽癌的发病是环境、病毒、基因多种因素相互作用导致的。大规模的流行病学调查和分子生物学实验已证实了慢性炎症与肿瘤的关系,发现至少有25%的恶性肿瘤和慢性炎症相关[13,14]。与其他头颈部鳞癌相比,鼻咽癌的显著特征是与EB病毒感染密切相关,EB病毒感染可诱导淋巴细胞募集密切及多种趋化因子的产生。组织学上可见鼻咽癌微环境中有大量的炎症细胞浸润,这些肿瘤浸润炎症细胞在鼻咽癌发生发展和侵袭转移的演进中发挥了异常重耍的作用[15]。鼻咽癌的发病是一个复杂的过程,涉及多条信号通路的交互作用,以炎症作为抗肿瘤药物的靶点进行研究意义重大。

RA是从唇形科迷迭香属植物迷迭香中提取的天然活性成分,其化学名称是[R(E)]α-{[3-(3,4-二羟基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基}-3,4-二羟基苯丙酸。RA在植物中广泛分布,以唇形科和紫草科含量最高。研究表明,RA分子结构中具有多电子的酚羟基,使其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等多种药理作用,在很多疾病中显现出极大的治疗潜能[16-19]。细胞实验证实,RA对多种肿瘤具有明显的抑制作用,可有效抑制癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡,如宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、乳腺癌等[20-22]。在本研究中,我们选用人鼻咽癌CNE-1细胞为模型,观察RA对其增殖的影响,结果表明不同浓度RA(20,40,80 μmol/L)处理细胞48 h均可抑制其增殖活性,且呈剂量依赖性。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡的过程,与肿瘤的发生发展密切相关,本研究中我们采用流式细胞技术,检测RA对CNE-1细胞的凋亡作用,结果表明不同浓度RA能够诱导CNE-1细胞发生凋亡。以上结果提示RA能通过抑制增殖,并促进凋亡从而在鼻咽癌中发挥抗肿瘤作用。目前,RA的抗肿瘤作用机制尚未完全阐明,研究表明可能与其调节线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡[23]、通过VEGF通路抑制肿瘤血管形成和肿瘤细胞迁移[24]等有关。与本研究结果相似,杨沛霖等的研究显示,迷迭香酸能剂量依赖性地抑制CNE-1细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与调控PTEN、PI3K/Akt/m TOR信号通路有关[8]。该研究小组还发现,迷迭香酸类似物RA-C1可有效地抑制鼻咽癌细胞CNE-1细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制很可能是通过激活依赖Caspase的线粒体通路促进CNE-1细胞的凋亡[25]。

炎症小体是一种细胞内大分子量的多蛋白复合体,是天然免疫系统的重要组成部分。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors 3)炎症小体是近年来备受关注的一种胞浆内模式识别受体,是研究较为深入的一类炎症小体[26]。NLRP3炎症小体由NLRP3、含胱天蛋白酶招募结构域(Caspase recruitment domain,CARD)的凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis-associated speck like protein,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(cysteiny aspartate-specific protease-1,Caspase-1)组成,各种危险信号通过激活NIRP3炎症小体,进而激活下游的炎症反应,在很多疾病中都发挥重要作用[27]。炎症影响肿瘤发生的所有阶段,其中包括NLRP3在内的炎症小体通过调节先天和适应性免疫反应、细胞死亡、增殖和/或肠道微生物群来影响癌症的发病机制,在多种癌症中的临床相关性突出了其作为分子靶点的治疗前景[28]。然而,目前关于NLRP3与鼻咽癌的研究较少,有研究发现,NLRP3在鼻咽癌组织中的表达显著高于正常鼻咽黏膜组织,NLRP3的表达水平与鼻咽癌的淋巴结转移、复发以及患者的临床预后有关[29,30]。本研究通过Western blot法检测不同浓度RA对CNE-1细胞NLRP3炎症小体蛋白NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表达水平的影响,表明RA能够不同程度抑制CNE-1细胞NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,且呈剂量依赖性,从而起到抑制炎症反应的作用。在多种恶性肿瘤,例如肺癌[31]、食管癌[32]中的研究,NLRP3炎症小体激活可直接增强肿瘤细胞的增殖和迁移能力,促进癌症的发生与进展,而本研究结果提示,RA可通过抑制NLRP3炎症小体的表达从而抑制CNE-1细胞增殖,诱导细胞凋亡。

综上,RA能够通过诱导凋亡抑制鼻咽癌细胞生长,且呈剂量依赖性,其作用机制可能与抑制NLRP3炎症小体信号通路有关。RA广泛的药理作用使其具有巨大的医用前景,本研究结果为临床上将RA用于治疗鼻咽癌提供了理论依据与靶点。然而,体外实验结果不能完全代表疾病的真实情况,RA是否能对鼻咽癌发挥治疗作用,还需要利用动物模型甚至患者进行深入研究。