HPLC法测定肝素钠注射液中含苯酚的量

袁 哲，尹燕杰 ,马宏宇

(哈尔滨市食品药品检验检测中心，哈尔滨150525)

肝素钠系自猪肠黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，是由不同分子质量的糖链组成的混合物.肝素钠注射液为肝素钠的灭菌水溶液，辅料包括注射用水、氯化钠，个别生产厂家会在生产过程中加入一定量的苯酚.苯酚是注射剂中常用的抑菌剂，同时也是世界公认的致癌物质.一方面，苯酚含量过低无法保证制剂质量;另一方面含量过高又会对人体产生危害.肝素钠注射液现行质量标准收载于《中国药典》2015年版二部[1]，但其标准中并未对可能添加的苯酚成分进行检测.本文通过参考相关文献[2-12]建立了HPLC法测定肝素钠注射液中含苯酚的量，为其质量标准提高提供依据.

1 仪器与试药

Waters 2695-2998高效液相色谱仪；Mettler电子天平XS105.苯酚对照品(批号100509-201804，体积分数为100%)，中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯)，实验用水为Milili-Q纯水机制备.肝素钠注射液(A厂家生产，规格2 mL，批号：1607319)、肝素钠注射液(B厂家生产，规格2 mL，批号：51709106)、肝素钠注射液(C厂家生产，规格2 mL，批号：1703103)

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为甲醇-水(60∶40)；流速1.0 mL·min-1；检测波长270 nm；柱温30 ℃，进样量10 μL.

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液

对照溶液(1) 精密称取苯酚对照品26.59 mg置5 mL量瓶中,加水溶解定容至刻度，摇匀，即得.

对照溶液(2) 精密称取苯酚对照品74.92 mg置25 mL量瓶中,加水溶解定容至刻度，摇匀，即得.

对照溶液(3) 精密称取苯酚约10 mg置100 mL量瓶中,加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得.

2.2.2 供试品溶液

精密吸取供试品1.0 mL置25 mL量瓶中,加水稀释至刻度，摇匀，即得.

2.3 系统适用性及专属性试验

精密吸取对照溶液(1)100 μL置10 mL量瓶中，用水稀释并定容至刻度，摇匀.吸取10 μL进样，在该色谱条件下，苯酚的保留时间约为6.1 min,理论塔板数大于10 000，拖尾因子为1.10，峰面积RSD为0.10%(n=7)；在被测的三个厂家的样品色谱图中，苯酚与相邻杂质峰的分离度均大于1.5，其他组分峰均不干扰苯酚的测定，专属性较好，典型色谱图见图1 .

图1 专属性HPLC图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

精密吸取对照溶液(1)50、100、200、400、600、800 μL分别置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度.再分别吸取10 μL进样，记录色谱图.以苯酚的质量浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，求得回归方程为：

Y=1.0×107X-1.314×104r=1

结果表明，苯酚在26.59～425.44 μg·mL-1质量浓度范围内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系.

2.4.2 精密度试验

取苯酚对照溶液(3)，连续进样6次,主峰面积的RSD=0.87%,保留时间的RSD=0.12%，表明仪器的精密度良好.

2.4.3 重复性试验

取供试品(1703103)照上述“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，以外标峰面积法计算含苯酚量.结果苯酚的平均质量浓度为2.47 mg·mL-1，RSD=0.36%，表明此方法的重复性良好.

2.4.4 稳定性试验

将供试品溶液(1703103)放置于室温，分别在0、2、4、6、8、12 h六个时间点，按上述“2.1”项下的色谱条件，分别进样并计算含苯酚的量，结果平均质量浓度为2.46 mg·mL-1,RSD=0.20%,表明供试品溶液在室温放置12 h内稳定.

2.4.5 回收率试验

分别精密吸取苯酚对照溶液(2)0.8、1.0、1.2 mL,各3份，分别置于25 mL量瓶中，再依次加入已知不含苯酚的肝素钠注射液1.0 mL，加水稀释并定容至刻度，设为低、中、高三个组，按“2.1”项下的色谱条件，分别计算每组的回收率(n=9).结果样品的平均回收率为99.23%，RSD为0.51%.结果见表1.

表1 回收率(n=9)

2.5 样品测定

按“2.1”项下的色谱条件，取对照溶液(3)及供试品溶液分别进样，按外标峰面积法,计算苯酚的标示百分含量，结果见表2.

表2 肝素钠注射液中含苯酚的量

3 讨 论

《中国药典》2015年版四部注射剂通则中规定，静脉给药注射液不得添加抑菌剂[13].但由于一些制剂的不稳定性，在其生产中可能会加入一定量的抑菌剂.抑菌剂在保证人体安全性的前提下，对制剂在贮存、应用过程中的制剂质量起到很大的作用.目前苯酚的测定方法很多，原料药采用的是溴量法，还有采用紫外法、气相色谱法等[2].本文建立了高效液相色谱法，以甲醇-水(60∶40)为流动相，测定肝素钠注射液中含苯酚的量.通过对市售三个厂家的样品测定发现，药品说明书中未标注添加了苯酚的品种，经检测均未检出苯酚.其中一个厂家标注了每100 mL中含苯酚0.25 g，经检测其含量为标示量的98.4%.经方法学考察，本方法简便、准确，可用于肝素钠注射液中苯酚的测定.