健康成人肠道菌群对烧酸奶的反应

姜铁民，刘 斌，刘彦品，黄训文，李 贞，李建涛，陈历俊*

（1 桂林理工大学化学与生物工程学院 广西桂林541004 2 北京三元食品股份有限公司 北京市乳品工程技术研究中心 北京100163）

人体肠道菌群是一个复杂的高度多样化生态系统，据估计由1014个细菌组成，健康个体的肠道微生物群落以放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和疣细菌门5 个细菌门为主[1]。近来许多研究揭示了肠道微生物对人体健康的重要作用，参与人体的正常生长发育、免疫、代谢、疾病等各方面，肥胖、糖尿病、肝脏疾病、癌症、神经退行性疾病等许多疾病与肠道微生物密切相关，人体肠道微生物被视为多种疾病的潜在新型疗法[1-4]。而饮食是影响人类肠道微生物结构和功能的关键因素，且饮食营养成分的变化能迅速改变肠道菌群组成，使饮食干预成为预防或治疗各种医学病症的方法之一[5-7]。酸奶作为历史悠久的发酵乳制品，越来越多研究表明酸奶对人体健康的作用，如维持健康的肠道微生物群，预防各种胃肠道疾病，降低肥胖、代谢综合征、心血管疾病、肿瘤等慢性疾病发病率，然而，目前益生菌及其发酵产品的健康功效仍存在争议，可能与观察指标、益生菌菌株及配方、干预时间等有关[8-13]，探索酸奶的健康效应及其需要解决的研究缺口，成为食品界重要的研究内容。烧酸奶是一种生牛乳经高温美拉德褐变反应，后乳酸菌发酵的酸奶，具有与传统酸奶不同的加工工艺，推测可能产生不同于传统酸奶的改变肠道菌群的效果。为此，本研究通过随机、开放试验，追踪观察了烧酸奶及其不同干预方式下健康人群肠道菌群的变化情况，为评价不同加工工艺和配方酸奶对人体的健康作用提供依据，同时为科学饮用酸奶提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 研究人群与干预方式

采用随机、开放研究方法，按“知情同意、自愿参加” 原则，2015年10月～11月在北京市招募到年龄20～55 岁，1 个月内未使用过抗生素的健康志愿者40 人，签署知情同意书后，按性别、年龄随机纳入NS，TS 组进行烧酸奶干预，早晚各200 mL，连续4～10 周。其中，NS 组直接饮用烧酸奶，TS 组经过2 周准备期（不食用任何益生菌、益生元产品）后饮用烧酸奶，且10 人接受2 周洗脱再次干预2 周。整个研究期间，要求参与者保持平常的生活方式和饮食，但不得使用任何其它酸奶或含益生菌的食物，并定期进行72 h 膳食回顾调查和粪便样本采集。本研究经洛阳北方企业集团有限公司职工医院伦理委员会批准。

1.2 粪便样本采集与肠道菌群16S rRNA 基因测序

NS 组人群分别在干预前（基线）、干预4 周、干预后2 周共3 个时间点采集粪便样本，TS 组于干预前（基线）、准备期2 周、第1 次干预4 周、洗脱期2 周、第2 次干预2 周共5 个点采集粪便样本，采集量约5 g，放入带有保护液的PSP 管中（Stratec，德国），-80 ℃保存，用于肠道微生物基因分析。

根据试剂盒操作说明，使用QIAamp 快速粪便DNA Mini 试剂盒 （Qiagen，GmbH，Hilden，德国），从100 mg 粪便样品中提取基因组DNA。然后以10 ng DNA 为模板，进行PCR 扩增V3-V4 区域 的16S rRNA 基因，30 μL 总反应体系为：15 μL 高保真PCR 反应混合液 （New England Biolabs），0.2 μmol/L 正向和反向引物 （314F-805R）。PCR 条件包括95 ℃，3 min；25 次循环：95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s。根据操作说明，使用NEB Ultra DNA 文库制备试剂盒（NEB，美国）生成测序文库，扩增子采用Illumina PE 2×250 bp HiSeq 2500 平台（Illumina，美国）进行测序。

1.3 数据处理与统计分析

肠道细菌测序结果使用QIIME 1.9.0[14]合并、质量筛选和demultiplex 原始下机测序数据。序列进行聚类，并将具有97%的相似性的序列归为操作分类单元（OTU），然后将OTU 序列根据Greengenes 16S rRNA 基因数据库（Version 13.5）进行物种注释，分类为从门到属的级别。下游数据使用Calypso 8.84 平台分别进行TSS 和CSS 方法归一化后，采用Rank test，Kruskall-Wallis 检验（非参数）进行差异统计分析，以FDR（False Discovery Rate）或BH（Benjamini-CHochberg）校正后的P 值确定差异显著性，统计检验均为双侧检验，P＜0.05为有显著性差异，微生物菌属的含量以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 研究对象及饮食基本情况

根据入组标准，招募符合要求的40 人进入试验，按性别比例随机分成2 组：NS 组直接干预4周；TS 组经10 d 清空期后干预4 周，洗脱15 d 再干预2 周。最终全部完成不同周期干预的志愿者为35 人（73%），分别为NS 组17 人、TS 组18 人，除谷类、薯类主食外，两组成员在性别、年龄和膳食摄入量方面不存在显著差异（表1）。

表1 完成跟踪观察的人群组成及其每日饮食情况Table 1 The volunteers and their daily dietary intake who completed the follow-up study

2.2 干预对肠道菌群多样性的影响

人体肠道菌群随着膳食营养、饮食习惯、激素分泌水平及抗生素使用等因素不断变化，饮食结构与习惯不同可影响肠道微生物群的构成，进而改变机体能量和营养物质代谢，间接参与肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发生发展[2-3，15]。本研究在日常饮食结构基本相同的情况下，观察了烧酸奶摄入及摄入方式对健康成人肠道菌群多样性的影响。α-多样性分析表明，两组研究人群入组时的肠道菌群结构类似（ANOVA P＞0.05），经过4～6 周酸奶干预，肠道微生物丰富度指标Chao1，ACE，Richness 指数显著升高，且TS 组样本显著高于NS 组（ANOVA P＜0.05，图1a，b），表明干预后，尤其是TS 组肠道微生物物种种类增加。肠道微生物群落结构β-多样性PCoA（基于Bray-Curtis 距离）分析结果显示2 组肠道菌群整体结构在干预前后和组间均无显著性差异（图1c，d）。

2.3 干预对优势肠道菌群结构的影响

不同时间粪便样本的菌群构成分析显示，健康成人肠道微生物主要检测到9 个菌门、70 个菌属。其中，厚壁菌门（Firmicutes，35.2%～58.4%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，30.0%～54.3%）、变形杆菌门（Proteobacteria，3.1%～8.1%）为主要优势菌门，占肠道微生物群总相对丰度的95%（见图2）；在属水平分类上，平均相对丰度在5%以上的有拟杆菌属（Bacteroides）、普雷沃氏菌属（Prevotella）、未分类瘤胃球菌科（unclassed.Ruminococcaceae）、未分类梭菌目（Unclassified.Clostridiales）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、粪杆菌属（Faecalibacterium），与报道的健康人体肠道优势菌群一致[16-18]，且存在所有观察点样本中（见表2）。但拟杆菌门及其普雷沃氏菌属（14.5%）、瘤胃球菌属（5.75%）、双歧杆菌属 （Bifidobacterium，0.85%）、Akk 菌属（Akkermansia，2.4%）等主要优势菌和益生菌相对丰度不同于Nishijima 等[19]分析的中国人肠道菌群结果，乳杆菌属（Lactobacillus，0.2%）、粪杆菌属（5.09%）与其结果接近。

图2 烧酸奶干预对肠道菌群结构的影响Fig.2 Effects of burned yogurt intervention on the structure of intestinal microbiota

相较于干预前，烧酸奶摄入4 周可降低变形菌门、放线菌门丰度（Actinobacteria），促进拟杆菌门富集，且停用2 周（洗脱期）内具有持续效果，而再次干预2 周则降低拟杆菌门丰度，同时促进变形杆菌门、疣微菌门（Verrucomicrobia）富集（图2），但干预后所有优势菌门的相对丰度与基线比较均没有显著差异。在属水平上，烧酸奶可降低普雷沃氏菌属、拟杆菌属、瘤胃球菌属、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）等优势菌丰度，促进粪杆菌属、Akk 菌属、嗜血杆菌属（Haemophilus）、未分类梭菌目、巨单胞菌属（Megamonas）富集，但主要与干预方式有关（表2）。对于双歧杆菌和乳杆菌益生菌，干预期呈下降趋势，其中双歧杆菌干预4周末丰度为干预前的1/3（0.5%），但随着再次干预上升到0.72%，与Burton 等[11]报道的酸奶干预效果相似。与基线比较，NS 和TS 组干预终点样本中的未分类梭菌目、考拉杆菌属、巨单胞菌属、AKK菌属相对丰度存在显著差异，但FDR 调整后无显著差异，说明长期饮食习惯在塑造肠道菌群结构中发挥重要作用。值得注意的是，链球菌属（Streptococcus）丰度在再次干预2 周时非显著性高于基线值，但分析所有阶段间差异菌群时发现，链球菌属是唯一存在显著性差异的肠道菌群（BH调整后P=0.009），于干预期第21 天达到最大值3.41%，推测与烧酸奶发酵生产用唯一菌种嗜热链球菌有关。

表2 健康人群烧酸奶干预前、后优势肠道菌群丰度aTable 2 Changes of intestinal microbiota after burned yogurt intervention in healthy adultsa

（续表2）

2.4 干预方式对优势肠道菌结构的影响

利用稀疏偏最小二乘-判别法（sparse partial leat square-discriminant analysis，sPLS-DA）分析了2 种干预方式（TS 和NS）人群的肠道菌群结构差异，结果显示2 组无显著性差异（见图3a）。采用线性判别分析效应量法[linear discriminant analysis （LDA）effect size method （LEfSe）]分析了前30 种优势菌属在NS 与TS 组间具有统计学差异的微生物，发现瘤胃球菌属、双歧杆菌属、布劳特氏菌属、萨特氏菌属及未分类理研菌科、梭菌目等在TS 组占显著优势，普雷沃氏菌属、厚壁菌门的考拉杆菌属、梭杆菌属（Fusobacterium）为NS 组的显著优势菌（图3b）。

图3 不同干扰方式对优势肠道菌群结构的影响Fig.3 Effects of different interference modes on the structure of dominant microbiota

ALDEX2 差异分析表明，拟杆菌门（Pa＜0.001）及其普雷沃氏菌（Pa＜0.001）、厚壁菌门的考拉杆菌属（Pa＜0.001）、瘤胃球菌属（Pa=0.008）、粪杆菌属（Pa=0.032）及放线菌门（Pa＜0.001）与双歧杆菌属（Pa＜0.001）、梭杆菌门（Pa＜0.001）与梭菌属（Pa=0.002）存在显著差异（见表3）。其中，普雷沃氏菌属、考拉杆菌属、粪杆菌属、梭菌属丰度在NS 组显著高于TS 组，瘤胃球菌属、双歧杆菌属显著低于TS 组，说明干预方式可显著影响肠道菌群组成，尤其是厚壁菌门菌属种类。此外，AKK 菌属和乳杆菌属在2 组样本中没有统计学差异，TS 组丰度高于NS 组。

表3 NS 与TS 组优势菌的差异分析aTable 3 Difference analysis of dominant microbiota between NS and TS groupa

3 讨论

宏基因组测序技术已发现，拟杆菌门和厚壁菌门是人类肠道的核心微生物群，变形杆菌门、放线菌门和疣微菌门丰度较低[16]，但人类肠道微生物群呈现高度动态变化状态，受抗生素、年龄、宿主遗传、饮食模式和其它环境暴露因素的影响[20-23]。其中饮食是重塑肠道菌群结构和功能最为重要也是最为迅速的因素，但确切改变时间和程度与食物种类、干预时间、个体差异相关，如补充膳食纤维情况下，有的个体1 d 就观察到肠道菌群结构变化，有的12 周后也没有影响，且停止食用后可恢复[6]，只有长期的饮食习惯才能引起肠道菌群组成的重大变化[1，7]。本研究中受试者准备期、干预期、洗脱期各阶段肠道菌群肠的变化充分说明了饮食结构或习惯短期内对肠道菌群的影响（结果未示），而干预前后结果显示，布朗旎烧酸奶干预4～6 周肠道微生物结构多样性显著高于干预前（特别是TS 组，P＜0.05，图1），厚壁菌门（未分类梭菌目、粪杆菌属、链球菌属）、拟杆菌门（拟杆菌属、普雷沃氏菌属）、变形菌门（嗜血杆菌属）、放线菌门（双歧杆菌属）、疣微菌门（Akk 菌属）等主要优势微生物（相对丰度＞1%）含量发生了不同程度的变化，其中未分类梭菌目、考拉杆菌属、巨单胞菌属、AKK 菌属相对丰度在干预终点与干预前样本中存在显著差异（Rank test），链球菌属在各观察时间段之间具有显著差异（ALDEX2），说明烧酸奶在增加健康人群肠道菌群结构多样性基础上，对个体优势肠道菌群相对含量的调节效果在所选择的观察点有限，但不排除烧酸奶摄入所导致的肠道菌群结构变化迅速，进而通过改变肠道内环境或代谢调节肠道菌群平衡[18，24]。

SCFAs 是肠道微生物群的主要代谢产物，对维持肠道正常内环境、功能和机体健康具有重要作用，其中丁酸是维持肠道稳态的关键分子[18]。发酵奶干预研究显示，健康成年人在酸奶干预后肠道微生物群发生了变化，主要包括韦荣球菌属、罗氏菌属、粪杆菌属、毛螺菌属、粪球菌属、乳杆菌属、链球菌属等重要产丁酸细菌丰度的增加，以及拟杆菌属、嗜胆菌属（Bilophila）等机会致病菌的降低，从而有利于人体健康[12-13]。本研究发现烧酸奶具有对健康成人肠道菌群不完全一致的干预效果，如粪杆菌属、毛螺菌属、乳杆菌属、链球菌属、拟杆菌属变化趋势与报道类似，但粪球菌属、罗氏菌属、韦荣球菌属呈降低趋势，且与干预方式密切相关（表2、表3）。此外，烧酸奶干预还能促进Akk菌属、嗜血杆菌属、未分类的梭菌目、巨单胞菌属富集，降低普雷沃氏菌属、考拉杆菌属等优势菌丰度（表2），但除链球菌属外均无统计学差异。而对于双歧杆菌，有报道显示健康人摄入含益生菌酸奶可显著增加粪便中双歧杆菌含量，且与性别及最初粪便中含量相关[8，25]，但也有研究发现，健康成年人肠道菌群的变化与酸奶干预后益生菌的摄入没有关联，甚至导致双歧杆菌水平的下降，说明酸奶中其它成分可能也是导致特定微生物变化的原因[11，26]。本研究中双歧杆菌水平干预降低，其中干预4 周末丰度为干预前的1/3（0.5%），随着再次干预上升到0.72%。健康成人肠道菌群对烧酸奶这种差异反应可能与烧酸奶所采用的单一发酵剂、特殊生产工艺所导致的营养与活性组分不同有关，有待进一步研究。

综上所述，本研究采用短期小样本干预试验和16S 基因组学技术，获得了性别、年龄、种族、饮食结构基本相似的健康成人的肠道微生物结构特征，其中厚壁菌门、拟杆菌门、变形杆菌门为主要优势菌门，占肠道微生物群总相对丰度的95%；拟杆菌属、普雷沃氏菌属、未分类的瘤胃球菌科、未分类的梭菌目、瘤胃球菌属、柔嫩梭菌属为主要优势菌属。同时证实饮食结构能调节健康成人肠道微生物组成，烧酸奶摄入可显著增加肠道菌群种类多样性和链球菌相对丰度，且食用习惯（干预方式）对肠道菌群结构影响更显著，食用时间越长越有助于保持双歧杆菌、Akk 菌、链球菌等有益菌的含量。由于日常饮食动态变化和机体自身调节作用，健康人群营养干预更难得到准确的试验结果，需采用系统流行病学方法，结合基因组学、代谢组学、蛋白质组学等技术，综合研究健康人群的营养干预效果，为改善健康和制定个性化的精准营养方案提供依据[27]。此外，健康成人肠道微生物组对布朗旎烧酸奶反应变化不同于以往报道的酸奶（含和不含益生菌）干预结果，造成这种差异的原因与机理还有待进一步深入研究。