液相色谱-串联质谱法鉴别驴肉真伪

张颖颖，李莹莹，李石磊，郭 超，李慧晨，王守伟

（中国肉类食品综合研究中心 北京100068）

驴肉不仅肉质红嫩、纤维细腻[1]、口感劲道，而且蛋白质含量高，必需氨基酸种类丰富，其氨基酸总量高于日常食用的猪肉、牛肉、羊肉等，能为人类提供丰富的优质动物源性蛋白资源[2]。除此之外，驴肉中的脂肪含量较低，并且多不饱和脂肪酸含量高于其它畜禽肉，能够更好地满足人体的营养需求[3]，因此驴肉更适宜高血压、肥胖症、动脉硬化患者及老年人等人群食用[4]。然而，由于驴的生长周期较长，资源相对匮乏，导致驴肉价格不断攀升。不法商贩为谋取不正当利益，常使用较为廉价的肉代替驴肉生产销售。畜肉中牛肉和羊肉的价格较高，而禽肉的肉质、色泽及口感与驴肉相差较大，因此驴肉中常被掺入猪肉和马肉，这种行为不仅欺骗消费者，损害消费者利益，而且不利于市场公正。

目前，测定驴肉掺假的方法主要包括基于形态学、代谢物、核酸及蛋白质的检测方法。形态学方法是通过观察外貌及辨别气味对肉的品种及品质进行鉴定[5]，该方法受主观影响较大，操作繁琐费时，偏差较大[6]。基于代谢物的检测方法是通过测定肉中的小分子化合物，如糖、脂肪酸、氨基酸等进行鉴定，主要包括近红外光谱法[4，7-8]、高效液相色谱法[9-11]等。由于代谢物易受到生长环境、年龄、肉制品的加工条件等外界因素的影响，因此在鉴定准确性方面有待进一步提升。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术可通过测定基因序列鉴定物种，其准确性高，灵敏度强，是目前测定掺假的主要方法，也是现行国家及行业标准[12]指定的检测方法，目前常用种特异性PCR 技术[13]、限制性片段长度多态性PCR 技术[14-15]、荧光定量PCR 技术[16-18]、多重PCR 技术[19]、DNA 条形码[20]等。然而，PCR 技术也存在一定的问题，如易受复杂基质的干扰[21]，加工过程中易降解[22-23]等。基于蛋白质的检测方法主要是对不同物种间的特异性蛋白质进行测定，有电泳法[24]、免疫法[25]等。然而，蛋白质较易发生变性，且物种之间易发生交叉污染，因此通过测定蛋白质来鉴定物种的应用越来越少。随着蛋白质组学的快速发展，在食品掺假方面的应用也越来越广，主要以物种的特异性肽段作为生物标志物进行鉴别[26-29]。肽段是蛋白质的一级结构，在热加工过程中比DNA 更稳定[30]，在深加工肉制品方面具有不可比拟的优势，并且其前处理较为简便，可同时测定多个物种。

本研究基于蛋白质组学理论，针对当前恶意混入猪肉和马肉的驴肉掺假问题，采用高分辨质谱进行数据采集及分析，建立主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）数据模型，并分别筛选马、驴、猪的特异性多肽链，建立液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography -tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鉴别驴肉掺假的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胰蛋白酶（测序级）及二硫苏糖醇（DTT）（生化级），美国Promega 公司；甲酸、乙酸（HAC）、乙腈（ACN）（色谱纯级），德国Merck 公司；碘乙酰胺（IAA）、三氟乙酸（TFA）（生化级），美国Sigma 公司；HLB 固相萃取柱，美国Waters 公司；尿素、硫脲、盐酸（分析纯级），上海国药集团化学试剂有限公司。

生鲜猪肉、驴肉和马肉均来自屠宰场，市售驴肉及其制品均购买于当地菜市场、超市、便利店或餐馆。

1.2 仪器与设备

液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱系统Q Exactive HF-X （配有电喷雾离子源ESI）及TSQ 超高效液相色谱串联四级杆质谱仪 （配有电喷雾离子源ESI），美国Thermo 公司；固相萃取装置，美国Agilent 公司；高速冷冻离心机，日本Hitachi 公司；氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 通过前期的试验摸索[31]，优化了样品前处理过程，包括蛋白质提取、酶解和除盐步骤。

蛋白质提取：称取1 g 样品，加入5 mL 提取溶液 （0.05 mol/L Tris-HCl，7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，pH 8.0），冰水浴下均质。用5 mL 提取溶液清洗刀头，合并溶液，涡旋，离心（4 ℃，12 000 r/min）20 min。此过程使用高浓度尿素促使蛋白质变性，提高其溶解度。

酶解：取适量上清液，加入DTT 溶液，涡旋（混合溶液中DTT 的浓度为5 mmol/L），56 ℃振荡反应1 h 还原蛋白质多肽链之间的二硫键，打开蛋白质的三维结构，裸露酶切位点，便于后续酶解反应。放置室温后，加入IAA 溶液，涡旋混匀（溶液中IAA 的浓度为10 mmol/L），暗处反应30 min 使打开的二硫键基团发生乙酰化反应，避免二硫键再次形成。加入DTT 溶液（终浓度为5 mmol/L），暗处反应15 min 去掉多余的IAA，避免影响后续酶切反应。加入5～6 倍溶液体积的缓冲液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）稀释尿素的浓度，避免高浓度的尿素使蛋白酶变性。按照蛋白质∶胰蛋白酶=50∶1（质量比）的比例加入胰蛋白酶溶液，调节pH 值为8.0，37 ℃过夜反应。

除盐：放置室温后，用0.5% TFA 调节pH ＜2，终止酶解反应。依次用乙腈、乙腈∶水=1∶1（体积比）溶液、0.1% TFA 活化HLB 固相萃取柱，上样后依次用3 mL 0.1% TFA，2 mL 0.5% HAC 淋洗，采用2 mL ACN∶0.5% HAC=3∶2 （体积比）的混合液洗脱，过0.22 μm 滤膜，备用。

1.3.2 高分辨液-质联用仪（LC-QE）

1.3.2.1 仪器条件 色谱条件：色谱柱Hypersil GOLD C18 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.2 mL/min；柱温40 ℃，进样量5 μL；流动相及梯度洗脱程序见表1。

表1 LC-QE 流动相及梯度洗脱程序Table 1 LC-QE mobile phase and gradient elution program

质谱条件：喷雾电压3 400 V，毛细管温度320℃，鞘气流速40 Arb，辅助流速15 Arb，全扫描分辨率120 000，扫描质量范围为350～2 000，自动增益值为3×106，注入时间为100 ms，二级扫描，topN为10，分辨率为30 000，AGC 值为2×105，IT 时间为50 ms，碰撞能量为30 eV。

1.3.2.2 数据分析 用蛋白质组学处理软件Proteome Discoverer 软件（Thermo）对高分辨质谱采集的数据进行非标记定量分析，检索数据库为Uniprot 全库，最多漏切位点设为2，每个多肽最大平均修饰为3，可变修饰为氧化，Oxidation （蛋氨酸，Methionine），乙酰化，Acetylation （蛋白N端，Protein N-term），固定修饰为氨甲酰甲基，Carbamidomethyl （半胱氨酸，Cysteinine），母离子质量偏差为10×10-6，多肽最小长度为7，其它参数为默认值。

采用悟空数据分析平台（https：//www.omicsolution.org/wu-kong-beta-linux/main/）对Proteome Discoverer 软件处理的数据进行主成分分析，利用Origin 软件作图。

1.3.3 液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）

1.3.3.1 仪器条件 色谱条件：色谱柱Hypersil GOLD C18 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.2 mL/min；柱温40 ℃，进样量20 μL；流动相及梯度洗脱程序与LC-QE 的过程一致，详见表1。

质谱条件：喷雾电压3 500 V；鞘气38 Arb；辅气15 Arb；离子传输管温度275 ℃；离子源雾化温度380 ℃；采集周期为1.0 s；碰撞气压力为1.5 mTorr；Q1 和Q3 分辨率都为0.7。

1.3.3.2 数据分析 通过Proteome Discoverer 软件找出驴肉、猪肉及马肉的专属性多肽链，并通过查看二级碎裂谱图，筛选每个多肽链的母离子与子离子信息，转换为适于LC-MS/MS 的质谱采集方法。将该采集方法导入LC-MS/MS 中，对驴肉、猪肉及马肉分别进行多反应监测模式 （MRM）扫描，通过对比每组离子对的保留时间、响应强度等信息，对每个物种的特异性离子对进行筛查，以确定定性及定量离子对，离子对信息见表2。

本研究的试验流程图如图1所示。

图1 试验流程图Fig.1 Experimental flow chart

表2 驴肉、猪肉及马肉MRM 采集参数Table 2 MRM parameters of donkey，pig and horse

2 结果与分析

2.1 专属性多肽链的筛选

采用高分辨的全扫描结合ddMS2的扫描模式，对样品溶液进行数据采集。将采集数据导入Proteome Discoverer 软件中，结合Uniprot 数据库，进行非标记定量分析，最终共检索到匹配多肽12 047 条。对各个物种的特异性参数进行设置，即筛选一个物种的多肽时，可信度设置为高，其它物种均设置为未检出，经筛选之后，共得到552 条多肽，因此通过特异性参数设置后，可以删除90%不符合的多肽信息。各个物种的专属性多肽应来自本物种自身含有的蛋白质，而部分多肽并非来源于该物种本身的蛋白质，而来自于其它物种，这主要是由于各个物种所含的蛋白质的种类大体相同，而其中的部分肽段存有差异，在搜库的过程中，会存在物种匹配错误的情况，因此还需剔除错误数据。此外，通过定量数据可以判定多肽在仪器中的响应强度，可通过设置响应强度参数进一步筛选物种专属性多肽。最终筛选出50 条马的专属性多肽链、48 条驴的专属性多肽链、50 条猪的专属性多肽链，分析每个多肽的二级谱图，通过响应值强度，确定每个多肽的母离子及子离子。

LC-MS/MS 采用MRM 扫描模式对化合物进行测定，通过二级子离子进行定性及定量，因此基质干扰小，准确性高，并且LC-MS/MS 的普及度高，更适用于日常的食品检测。但LC-MS/MS 的分辨率较LC-QE 低，因此将LC-QE 中筛选的多肽的母离子与子离子信息导入至LC-MS/MS 后，还需通过离子响应强度、峰形、基质干扰、丰度信息等，进一步筛选适合应用至LC-MS/MS 中的多肽及其离子对信息，最终筛选了猪、驴、马的专属性多肽各3 条，详细信息见表3，离子对信息见表2，图2分别为多肽驴_1、猪_1 与马_1 的3 个子离子的选择离子流图。

2.2 方法灵敏度及准确度

由2.1 节所得物种专属性多肽链是从纯生鲜肉中筛选出的，虽然多肽在热加工处理过程中比DNA 的稳定性更强，但是不同的热加工处理方式会影响蛋白质的性质及结构，进而影响样品前处理过程中的酶解效率，从而影响多肽的响应，因此还需对不同热加工处理的肉制品进行验证。

为了验证该方法的准确度，将猪肉、马肉按照质量比10%掺入驴肉中，并根据不同生产工艺进行不同热处理，分别为78 ℃加热、100 ℃加热、121℃高压灭菌、烧烤。将热处理后的样品按照本文建立的方法进行样品制备及LC-MS/MS 数据采集，结果如图3a 所示，猪、马、驴3 个物种的3 条专属性多肽链全部检出，证明该方法对生鲜肉及不同加工方式的肉制品均有良好的准确度。

为了测定该方法的灵敏度，将猪肉、马肉按照质量比0.5%掺入驴肉中，进行样品处理及数据分析，结果如图3b 所示，猪与马的3 条专属性多肽链均检出，证明该方法可以测定0.5%的掺假比例，而一般认为食品中1%以下的掺假不属于人为恶意掺假[32]，因此该方法的灵敏度完全满足食品掺假检测要求。

表3 猪、马、驴的多肽信息Table 3 The peptide information of pig，horse and donkey

图2 驴肉、猪肉与马肉选择离子流图Fig.2 MRM chromatograms of donkey，pig and horse

图3 掺假试验提取离子流图Fig.3 MRM chromatograms of adulteration test

2.3 实际样品测定

根据本试验的前处理方法及仪器条件，对从当地不同的菜市场、超市、便利店、餐馆中购买的生鲜驴肉及驴肉制品，包括驴肉火烧、五香驴肉、酱汁驴肉、酱卤驴肉、驴肉干等，进行样品分析，最终在一驴肉制品（五香驴肉）中检出马的专属性多肽，可判定该食品中掺入了马肉，其色谱图如图4所示；将该样品用PCR 进行测定，其结果与LCMS/MS 方法一致。而其它食品未检测出猪、马成分。

图4 样品的提取离子流图Fig.4 MRM chromatograms of sample

2.4 主成分分析

将通过特异性参数设置后所筛选出来的552多肽的定量信息提取出来，进行主成分分析（PCA），由碎石图（图5a）可知，第1 主成分的方差贡献率为83.3%，第2 主成分的方差贡献率为10.7%，2 个主成分的累积贡献率为94%，说明这2 个主成分能够充分的表示3 个物种的多肽信息。由此绘制二维主成分分析图，结果如图5b 所示。从中可以看出，3 个物种能够完全区分，之间互不干扰。

为判定该模型的准确性，将2.3 节实际样品中的3 个样品溶液进行高分辨数据采集及分析，分析结果如图5b 中绿色五角星所示。其中样品2与样品3 处于驴的分布区，由此判定样品2 与样品3 为驴肉；而样品1 处于驴和马的分布区的中间位置，判定其含有驴肉和马肉。该结果与液相色谱串联质谱方法所得到的结果一致，也进一步证明了该模型的准确性。

图5 驴肉、猪肉与马肉的主成分分析碎石图（a）与PCA 分析图（b）Fig.5 Scree plot （a）and PCA （b）of donkey，pig and horse

3 结论

本研究建立了测定掺假驴肉的液相色谱-串联质谱方法。利用高分辨质谱进行数据采集，通过Proteome Discoverer 软件进行非标记定量分析，通过参数设置，用筛选的数据创建了PCA 分析图，并进行了方法验证；此外通过参数设置进一步筛选了猪、驴、马的专属性多肽链，转换为特异性离子对信息，导入LC-MS/MS 中，创建了液相色谱-串联质谱方法，最低可测定0.5%的掺假比例，该方法操作简便，可同时测定多个物种，灵敏度高，准确可靠，可用于日常食品检测。