DNA条形码技术鉴定污染蛋糕的真菌

孟燕华，闫倩倩，贺 婷，张永杰

（山西大学生命科学学院 太原030006）

蛋糕通常是以蛋、糖、面粉和/或油脂为主要原料，经调制成面糊，浇入模盘，焙烤后制成的一种组织松软的糕状制品[1]。蛋糕含有丰富的营养物质，水分和蛋白质含量较高，使得蛋糕的保存期较短，容易腐败变质。导致蛋糕腐败变质的主要因素是微生物污染，包括细菌、酵母菌、霉菌等。近年来，多地都有蛋糕食品微生物超标的相关报道[2-6]。

蛋糕微生物的污染源可能是工人、原材料、环境、包装等[7]。蛋糕微生物在条件适宜时开始生长繁殖，随着微生物种类和数量的剧增，蛋糕就会发生恶变，表现为糖类、脂肪分解，蛋白质变质，产生臭味等。微生物过量生长除导致蛋糕变质外，有些微生物还会产生毒素，一旦进入人体，会对人体健康造成危害[8]。特别是蛋糕被真菌污染后，真菌在蛋糕上形成明显的菌落（即霉斑），直接导致蛋糕失去商业价值。研究引起蛋糕变质的微生物种类，对于在蛋糕加工和存放过程中采取合理的防控措施，以及保障消费者的身体健康具有重要的意义。目前关于蛋糕微生物的研究报道绝大多数都是对微生物数量的检测[6]，而对具体微生物种类（尤其是真菌）的关注较少。

真菌广泛分布于各种自然和人为环境中，其物种数非常丰富，据估计至少有150 万种，被描述过的约11 万种[9]。为了准确鉴别不同的物种，近年来国际上提出了DNA 条形码计划，并推荐细胞核核糖体DNA 中的ITS 序列作为真菌首要的DNA条形码[10]。本文以引起某品牌蛋糕发霉变质的真菌为研究对象，分析蛋糕污染真菌的种类，评价ITS 条形码用于蛋糕污染真菌鉴定的可行性；分析是否存在潜在的致病菌。通过确定引起蛋糕发霉变质的真菌种类，指导蛋糕的合理加工与储存，保障消费者的食用安全。

1 材料与方法

1.1 材料

某品牌4 种不同风味的蛋糕（以A，B，C，D 表示不同的风味），每种风味各2～3 份样品（以“字母+数字” 表示每种风味的不同样品，如A1，A2，A3），共11 份样品（图1）。这些样品是山西大学生命科学学院某退休教师发现家中购买的蛋糕霉变后送来的，送到实验室时刚过保质期1 d（蛋糕正常的保质期为3～4 d），但能看到蛋糕表面真菌生长形成的菌落（图1）。

图1 研究使用的蛋糕样品Fig.1 Cake samples used in this study

1.2 仪器与设备

T100 PCR 仪，美国BIO-RAD 公司；Gel Doc XR+凝胶成像系统，美国BIO-RAD 公司。

1.3 方法

1.3.1 真菌菌株的分离与培养 以添加链霉素和四环素的PDA 培养基（即马铃薯葡萄糖琼脂培养基）作为分离真菌菌株的培养基。在无菌工作台中，用接种针从蛋糕上可见的真菌菌落上挑取少许菌丝到PDA 平板上，置20 ℃黑暗条件下培养，待菌落长大后，从菌落边缘挑取菌丝转接到PDA斜面保藏。

1.3.2 真菌菌株的鉴定与分析 将分离获得的真菌菌株接种到铺有灭菌玻璃纸的PDA 培养基表面，经培养后收集菌丝体，用十六烷基三甲基溴化铵法 （cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取基因组DNA[11]。以提取的DNA 为模板，使用引物ITS5 和ITS4 扩增ITS 序列[12]。扩增产物由金唯智生物科技有限公司（天津，中国）进行Sanger测序。得到测序结果后，用FinchTV 软件查看测序峰图（http：//downloads.informer.com/finchtv/），去掉引物及测序质量较差的端部序列后留下的序列进行后续分析。首先，利用DNAMAN 软件对所有菌株的ITS 序列进行比对，以97%的相似性阈值归并成不同的可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。然后，对各个OTU 选择1 个代表序列在BOLD（http：//www.barcodinglife.org/index.php/IDS_OpenIdEngine）和GenBank（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中进行相似性搜索，以此来确定各OTU 可能代表的真菌种类。此外，对找出的各个OTU 的代表序列在ISHAM 数据库中进行搜索（http：//its.mycologylab.org/），分析是否代表潜在的致病性真菌。最后，利用邻接法和K2P 模型，利用MEGA 软件对各个OTU 的代表序列及BOLD/GenBank 数据库中的相近序列构建系统发育树，并进行1 000 次重复的自展检验[13]。

1.3.3 真菌菌株回接试验 先将每一OTU 的代表菌株培养在PDA 平板中，然后从菌落边缘切取菌块，接种到购买的相同企业当日生产的（A）香醇芝士蛋糕（原味）和（C）切块夹心蛋糕上，分别置于4，20 和30 ℃培养，3 d 后观察真菌的生长情况。以不接真菌的蛋糕为空白对照。

2 结果与分析

2.1 菌株分离

本研究从11 份蛋糕样品上共分离到34 株真菌分离物。其中，从每份蛋糕样品上分离到1～5 个真菌菌株，从每种风味的蛋糕（各2～3 份样品）上共得到5～12 个真菌菌株（表1，图2）。

表1 不同风味蛋糕中分离的真菌菌株数和物种数Table 1 Number of isolates and OTUs of fungi isolated from cakes

图2 代表性真菌分离物的菌落形态Fig.2 Colony morphology of representative fungal isolates

2.2 菌株鉴定

从所有34 株真菌分离物中扩增ITS 序列，以97%的相似性阈值鉴别出9 种不同的真菌（表1，表2），全部为子囊菌，与公共数据库中已知序列的相似性都超过了99%。在这9 种真菌中，枝孢属（Cladosporium）有3 种（OTU1-3）；脉孢菌属（Neurospora）有1 种（OTU4）；青霉属（Penicillium）有2种（即OTU5-6）；曲霉属（Aspergillus）有1 种（即OTU7）；链格孢属（Alternaria）有1 种（即OTU8）；1种 （OTU9）为鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）。在这9 种OTU 中，OTU1 为优势种类（占总菌株数的44%），且在各种风味的蛋糕中均分离到；OTU3，4，5 各自在至少2 种不同风味的蛋糕中分离到，而其它OTU 只从1 种风味的蛋糕中分离到（表1）。从每种风味的蛋糕中共分离到2～6 种真菌不等（表1）。

表2 各OTU 所包含的菌株数及物种鉴定结果Table 2 Number of cultures and identification of each OTU

2.3 系统发育和潜在致病性分析

利用各OTU 的代表序列及公共数据库中的相近序列构建系统发育树，支持前面物种划分的结果，即存在9 种不同的OTU，且每一分支都有较高的支持度 （图3）。这些OTU 的代表序列在ISHAM 条形码数据库中都能找到相似性很高的序列（＞98%），暗示这些菌株具有潜在的致病性（表3）。

图3 基于ITS 序列的系统发育分析Fig.3 Phylogeny constructed using ITS sequences

2.4 菌株回接试验

将前面检测到的9 种真菌接种在香醇芝士蛋糕（原味）和切块夹心蛋糕上进行培养，结果显示，除OTU9 因生长慢而未观察到生长外，其它真菌均能在这两种蛋糕上生长（图4）。多数真菌在20℃和30 ℃培养3 d 后，可在蛋糕上形成明显的菌落，而在4 ℃培养时未能将菌落扩展到蛋糕上。OTU7 在30 ℃培养时，产生的孢子会四处分散生长。值得注意的是，2 种蛋糕的空白对照在20 ℃和30 ℃放置3 d 也观察到有真菌菌落形成，其中的真菌可能来源于蛋糕自身携带或包装材料污染。另外，我们还发现切块夹心蛋糕在30 ℃放置3 d，会呈现水渍状并略有塌陷。

表3 各OTU 在ISHAM 数据库中搜索的结果Table 3 Results of searching each OTU against the ISHAM Barcoding Database

3 结论与讨论

蛋糕因水分活度高、易受微生物污染而变质。本文调查了引起某品牌蛋糕变质的真菌，共得到34 株真菌分离物。利用真菌通用DNA 条形码ITS序列对这些菌株进行鉴定，发现9 种不同的OTU，包括枝孢属、脉孢菌属、青霉属、曲霉属、链格孢属和鲁氏接合酵母等。何艳霞等[14]在对蒸蛋糕的微生物菌群结构进行研究时，也发现了枝孢属、青霉属、曲霉属和链格孢属的物种。然而，本研究检测到的这些真菌属大都包含一些亲缘关系较近的物种，难以通过ITS 序列进行区分，需要使用其它DNA 片段或通过多个基因片段的联合分析，才能准确鉴定到种。例如，对于枝孢属，ITS 在不同物种间的分辨率较低，推荐使用肌动蛋白act 和翻译延长因子tef1 的联合分析[15]；曲霉属除ITS 外，还被推荐使用钙调蛋白基因CaM[16]；青霉属还可使用线粒体CO1 基因[17]。因此，若要将本文所得的真菌菌株准确鉴定到种，尚需对其它基因片段进行扩增分析，必要时还要结合形态特征观察的结果进行综合判断。除真菌外，我们从研究使用的蛋糕上还分离到8 株细菌，其中1 株被鉴定到芽孢杆菌属（Bacillus）。

图4 真菌菌株回接试验Fig.4 Inoculating fungal isolates back to cakes

蛋糕上这些真菌的来源应该至少存在以下2种可能。一种可能是蛋糕本身携带真菌。在蛋糕加工过程中，自身携带的一些真菌孢子仍具有活力，条件适宜时利用蛋糕的营养进行萌发、生长。另一种可能是来自各种外界环境，如物流配送环节、零售店铺的室内环境、消费者的贮存环境等都可能造成霉菌污染。实际上，本研究发现的许多真菌属（如枝孢属、青霉属、曲霉属、链格孢属）都是空气中的常见真菌[18]。因此，空气微生物造成蛋糕污染的可能性很大。然而，在回接试验中，我们发现买回的蛋糕即使在未拆封包装盒的情况下，在20 ℃和30 ℃放置3 d 后也可能长出霉菌斑 （图4），这又支持了第1 种假设。

通过搜索人体和动物病原真菌数据库ISHAM，我们发现这些污染蛋糕的真菌可能对人体具有潜在的致病性。因此，发霉的蛋糕不但不能再食用，还应在丢弃时进行无害化处理（如通过高温处理灭活真菌）。另外，本研究发现的多数真菌属（如青霉属、曲霉属、链格孢属）包含许多产毒素的物种[19]，因此，从蛋糕上分离到的这些真菌也有可能产生毒素，从而可能引起食物中毒。目前已有多起因食用污染微生物的蛋糕引起的食物中毒事件，虽然都是由细菌污染引起[8，20-21]。也有研究显示污染蛋糕的真菌能够产生毒素[22]，但真菌毒素的产生受多种因素的影响，本研究分离到的真菌菌株是否产毒素仍有待验证。