加减驻景方对脉络膜新生血管动物模型TLR-4、NF-κB 和IL-6 表达的影响

陶方方，亢泽峰，陈水龄，褚文丽，刘健，周志豪

脉络膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）是年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）、病理性近视、中心性渗出性脉络膜视网膜病变、眼组织胞浆菌病、眼底血管样条纹等疾病共同的终末病理环节[1]。CNV 的形成是多种细胞与多种因子共同作用的结果，近年来，白细胞介素-6（interleukin 6,IL-6）被发现与CNV 形成也有密切的关系，AMD 患者IL-6 表达较正常人有显著升高，且疾病严重程度与IL-6 表达水平相关[2]。加减驻景方是亢泽峰教授治疗AMD 和病理性近视等伴有CNV 眼底疾病的经验用方，临床治疗有效，其作用机制尚不清晰，本研究采用组织学和分子生物学技术检测CNV 动物模型中核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）信号通路相关因子活性，探讨ToLL样受体-4（ToLL-like receptor,TLR-4）/NF-κB/IL-6信号通路在CNV 形成中的作用，从而揭示加减驻景方抑制CNV 的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8 周龄雄性SPF 级BN 大鼠138 只，体重180～220 g，购买于北京市维通利华公司。动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。实验前，适应性饲养3 d。

1.2 试剂与仪器

PCR 仪（Biometra,TProfessional ThermoCycler），全自动荧光定量PCR 仪（7500,ABI）。SP-9000 试剂盒（中杉金桥），NF-κB（Cell Signaling Technology），TLR-4、IL-6（Abcam），cDNA 第一链合成试剂盒（K1622,Thermo Scientific）。

1.3 实验分组与给药

大鼠任一眼为实验眼，行激光造模，每只眼光凝8～10 个点。激光功率360 mW，光斑直径50 μm，曝光时间0.05 s。按随机数字表法将造模成功的大鼠分为模型组、中药组、西药组、联合组，各30 只。空白组18 只大鼠，正常饲养，不做特殊处理。

模型组：光凝后第1 d 予生理盐水灌胃，每日1次，共21 d。

中药组：光凝后第1 d 予中药灌胃，每日1 次，共21 d。中药加减驻景方由楮实子、枸杞子、菟丝子、五味子、茺蔚子、三七粉、桂枝、茯苓、三棱、郁金、生黄芪和当归等多种药物组成，每剂中药155 g，灌胃量10 ml/kg。

西药组：光凝后第1 d 予玻璃体腔注射康柏西普（Conbercept），共计1 次。康柏西普，成都康弘药业，规格10 mg/ml。5 μl 微量注射器玻璃体腔注射，1次，5 μl。

联合组：光凝后第1 d 予中药灌胃（同中药组），每日1 次，共21 d，光凝后第1 d 予玻璃体腔注射康柏西普（同西药组），共计1 次。

1.4 免疫组织化学法检测TLR-4、NF-κB、IL-6

模型组和各治疗组在光凝后第7 d、14 d、21 d各处死6 只大鼠取材。空白组在光凝后21 d 处死取材。制作组织切片，行免疫组织化学染色。石蜡切片脱蜡至水；PBS 洗涤5 min，3 次；抗原修复；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，10 min；1% Triton-100，室温1 h;试剂A，室温30 min；滴加稀释后的一抗，阴性对照用PBS 溶液代替，4°C 过夜；试剂B，室温下孵育30 min；试剂C，室温下孵育10 min；DAB染色；自来水冲洗，苏木素复染1 min，盐酸酒精分化30 s，氨水返蓝30 s；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，晾干；光学显微镜拍摄照片。一抗稀释倍数，TLR-4，1：200；NF-κB，1：100；IL-6，1：200。

每组选取15 张包含CNV 的免疫组化图像，Image Pro Plus 6.0 软件分析图像的平均光密度值（average optical density,AOD）值作为半定量测定阳性表达物的依据。

1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应检测TLR-4、NF-κB、IL-6 mRNA 表达

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）技术，光凝后21 d，每组各处死6 只大鼠获取眼杯，参照试剂盒方法用Trizol 一步法裂解组织，提取总RNA，按照试剂盒说明书，合成cDNA。配制反应体系如下：RealMasterMix 和SYBR 混合物10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl，超纯水定容至20μl，进行PCR 循环，95℃预变性10min；95℃变性20s、60℃退火30s、68℃延伸60s；循环40 次。引物由北京科悦达生物科技有限公司合成。

用空白组目的基因与内参GAPDH 的相对表达量进行校正，得到空白组目的基因mRNA 相对表达量为1 时，实验组目的基因mRNA 表达量是空白组的倍数。将2-ΔΔCt 视为各目的基因mRNA 的相对表达量。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.6 蛋白免疫印迹法检测TLR-4、NF-κB、IL-6 蛋白

采用蛋白免疫印迹（western blotting）技术检测目的蛋白表达，光凝后21 d，每组各处死6 只大鼠获取眼杯，获取蛋白质样品，测定总蛋白浓度，SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，起始电压设定为80 V，当样品进入分离胶时，调整电压至120 V，继续电泳，直至溴酚蓝跑至底部时，结束电泳。转膜；5%脱脂牛奶封闭，室温摇床孵育2 h；一抗4℃孵育过夜；1：5000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1h；显影液显影。

使用Quantity One 分析软件测定条带光密度值，以GAPDH 条带的光密度值校正，目的蛋白的相对表达量以目的基因条带的光密度值与GAPDH 条带的光密度值之比来表示。

1.7 统计学方法

采用统计学软件SPSS 21.0 进行数据分析。计量资料以平均数±标准差（）描述，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用方差分析中LSD-t 检验。当P＜0.05 时，则认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学结果

2.1.1 TLR-4 空白组大鼠视网膜组织中可见TLR-4 表达，视网膜神经节细胞层、内核层可见少量阳性反应物。模型组和各治疗组CNV 组织中可见黄棕色阳性反应物，TLR-4 呈阳性表达。模型组TLR-4 表达量在光凝后14 d 时最大，21 d 时显著减少，有统计学意义（P＜0.05）。各治疗组TLR-4 表达量在光凝后7 d 时最大，随后减少，有统计学意义（P＜0.05）。

光凝后7 d、14 d 与21 d，各治疗组TLR-4 表达量均低于模型组。光凝后7 d 与21 d，联合组TLR-4表达量最低，中药组次之，中药组TLR-4 表达量低于西药组。光凝后14 d，西药组TLR-4 表达量高于中药组和联合组，中药组和联合组之间无明显差异。（表2、3，图1）。

表2 光凝后不同时间各组TLR-4 的AOD 值变化（，n=15）

表2 光凝后不同时间各组TLR-4 的AOD 值变化（，n=15）

注：※ 与同时间段模型组比较，P＜0.05；# 与同时间段中药组比较，P＜0.05；&与同时间段西药组比较，P＜0.05；* 与同时间段联合组比较，P＜0.05

表3 光凝后不同时间各组TLR-4 的AOD 值比较统计值

2.1.2 NF-κB 空白组大鼠视网膜组织中可见NF-κB表达，视网膜神经节细胞层可见少量阳性反应物。模型组和各治疗组CNV 组织中可见大量黄棕色阳性反应物，NF-κB 呈强阳性表达。模型组NF-κB 表达量在光凝后14 d 最大（P＜0.05），21 d 时变化不明显。各治疗组NF-κB 表达量在光凝后7 d 最大，联合组随后无明显变化，中药组和西药组21 d 时减少（P＜0.05）。

光凝后7 d、14 d 与21 d，各治疗组NF-κB 表达量均低于模型组。光凝后7 d，联合组NF-κB 表达量低于西药组和中药组，西药组和中药组之间无明显差异。光凝后14 d，联合组NF-κB 表达量最低，中药组次之，中药组NF-κB 表达量低于西药组。光凝后21 d，联合组和中药组NF-κB 表达量均低于西药组，联合组和中药组之间无明显差异（表4、5，图2）。

表4 光凝后不同时间各组NF-κB 的AOD 值变化（，n=15）

表4 光凝后不同时间各组NF-κB 的AOD 值变化（，n=15）

注：※ 与同时间段模型组比较，P＜0.05；# 与同时间段中药组比较，P＜0.05；&与同时间段西药组比较，P＜0.05；* 与同时间段联合组比较，P＜0.05

2.1.3 IL-6 空白组大鼠视网膜组织中可见IL-6 表达，视网膜神经节细胞层可见少量阳性反应物。模型组和各治疗组CNV 组织中可见大量黄棕色阳性反应物，IL-6 呈强阳性表达。模型组IL-6 表达量在光凝后14 d 最大，21 d 时逐渐减少（P＜0.05）。各治疗组IL-6 表达量在光凝后7 d 最大，中药组在光凝后14 d 开始逐渐减少，西药组和联合组在光凝后21 d减少（P＜0.05）。

光凝后7 d，中药组和联合组IL-6 表达量均低于模型组，联合组IL-6 表达量低于西药组，其余组间无明显差异。光凝后14 d，各治疗组IL-6 表达量均低于模型组，联合组IL-6 表达量低于西药组和中药组，而中药组与西药组之间无显著差异。光凝后21 d，各治疗组IL-6 表达量均低于模型组，中药组与联合组IL-6 表达量无明显差异，均低于西药组（表6、7，图3）。

图1 TLR-4 免疫组化图像（DAB 染色，×400）。1A 空白组，正常BN 大鼠视网膜组织中TLR-4 呈阳性表达；1B 模型组7 d；1C 中药组7 d；1D中药组21 d；1E 西药组7 d；1F 西药组21 d；1G 联合组7 d；1H 联合组21 d。模型组和各治疗组CNV 中TLR-4 呈阳性表达（箭头）

图2 NF-κB 免疫组化图像（DAB 染色，×400）。2A 空白组，正常BN 大鼠视网膜组织中NF-κB 呈阳性表达；2B 模型组7 d；2C 中药组7 d；2D中药组21 d；2E 西药组7 d；2F 西药组21 d；2G 联合组7 d；2H 联合组21 d。模型组和各治疗组CNV 中NF-κB 呈强阳性表达（箭头）

表5 光凝后不同时间各组NF-κB 的AOD 值比较统计值

表6 光凝后不同时间各组IL-6 的AOD 值变化（，n=15）

表6 光凝后不同时间各组IL-6 的AOD 值变化（，n=15）

注：※ 与同时间段模型组比较，P＜0.05；# 与同时间段中药组比较，P＜0.05；&与同时间段西药组比较，P＜0.05；* 与同时间段联合组比较，P＜0.05

表7 光凝后不同时间各组IL-6 的AOD 值比较统计值

2.2 RT-qPCR 检测TLR-4、NF-κB、IL-6 mRNA 相对表达量

模型组与各治疗组各目的基因mRNA 相对表达量较空白组均有明显增多，各治疗组目的基因mRNA 相对表达量均低于模型组。各治疗组NF-κB mRNA 相对表达量由高到低依次为中药组、西药组和联合组。TLR-4 mRNA 相对表达量联合组最低，西药组与中药组无明显差异。IL-6 mRNA 相对表达量中药组最低，西药组与联合组无明显差异（表8、9）。

表8 TLR-4、NF-κB 与IL-6 mRNA 相对表达量（，n=9）

表8 TLR-4、NF-κB 与IL-6 mRNA 相对表达量（，n=9）

注：※ 与模型组比较，P＜0.05；# 与中药组比较，P＜0.05；&与西药组比较，P＜0.05；* 与联合组比较，P＜0.05

表9 TLR-4、NF-κB 与IL-6 mRNA 比较统计值

2.3 Western blotting 检测检测TLR-4、NF-κB、IL-6蛋白相对表达量

图3 IL-6 免疫组化图像（DAB 染色，×400）。3A 空白组，正常BN 大鼠视网膜组织中IL-6 呈阳性表达；3B 模型组7 d；3C 中药组7 d；3D 中药组21 d；3E 西药组7 d；3F 西药组21 d；3G 联合组7 d；3H 联合组21 d。模型组和各治疗组CNV 中IL-6 呈强阳性表达（箭头）

模型组和治疗组各目的蛋白相对表达量较空白组均有明显增多，各治疗组目的蛋白相对表达量均低于模型组。TLR-4 蛋白相对表达量西药组较高，中药组与联合组无明显差异。NF-κB 蛋白相对表达量中药组较高，西药组与联合组无明显差异。IL-6蛋白相对表达量中药组较低，西药组与联合组无明显差异（表10、11，图4）。

表10 TLR-4、NF-κB 与IL-6 蛋白相对表达量（，n=9）

表10 TLR-4、NF-κB 与IL-6 蛋白相对表达量（，n=9）

注：Δ 与空白组比较，P＜0.05；※ 与模型组比较，P＜0.05；# 与中药组比较，P＜0.05；&与西药组比较，P＜0.05；* 与联合组比较，P＜0.05

表11 TLR-4、NF-κB 与IL-6 蛋白相对表达量比较统计值

图4 Western blotting 图像

3 讨论

3.1 TLR-4/ NF-κB/IL-6 信号通路调控CNV 形成的机制

缺氧和炎症反应可以诱导内皮细胞表达IL-6，IL-6 是一种间接的促血管生成因子[3]，诱导眼内新生血管生成[4]。湿性AMD 患者房水中IL-6 的表达量与CNV 大小、黄斑中心厚度、黄斑容积有关[5-6]。激光诱导的CNV 模型中，抑制IL-6 可以下调血管内皮生长因子（vascular endothelium growth factor,VEGF）的表达，并且降低CNV 的大小[7]。激光诱导的鼠类CNV 模型是一种高水平的炎症模型[8]，本研究中模型组IL-6 蛋白和mRNA 表达量较空白组有显著增强。

IL-6 除了可以反馈性激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,PKB,AKT）/雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin,mTOR) 信号通路和PI3K/AKT/NF-κB 信号通路[9]，上调VEGF 表达促进血管新生以外，还可以通过自分泌的形式作用于被炎症因子激活的内皮细胞，诱导内皮细胞的增殖与迁移，直接促进血管生成[10]。

TLR-4/NF-κB 是细胞内重要的炎症信号通路之一，可以调控下游炎症因子IL-6 mRNA 的转录活性。TLR-4 在内皮细胞、中性粒细胞和单核巨噬细胞等细胞上有大量表达，TLR-4 识别胞外的革兰阴性菌脂多糖、热休克蛋白等物质，再经过髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor88,MyD88) 依赖性、非依赖性途径激活NF-κB。NF-κB 是哺乳动物细胞中的一种转录因子，通过与下游靶基因DNA 结合，发挥转录激活的功能。

本研究中，模型组表达的TLR-4、NF-κB、IL-6蛋白及mRNA 较空白组均有显著增强。氪激光诱导的BN 大鼠CNV 模型中，TLR-4/ NF-κB/IL-6 信号通路的激活促进了CNV 的生成。

3.2 加减驻景方抑制CNV 的可能机制

亢泽峰教授将AMD 归为中医眼科“瞳神络病”的范畴[11]，认为本病的病机主要为肝肾不足，兼具气血津液功能障碍，表现为瘀、痰、湿的本虚标实证，治以补肾明目、活血通络为要则，辅以利水渗湿、止血活血、益气养血、温阳通络之药。因此，组成了以“补肾明目、益气活血、化瘀通络”为治则的加减驻景方。

既往实验研究证实，加减驻景方具有抑制实验性CNV 的作用[12-13]，这可能与方中多种药物的抗炎利水、温阳通络作用有关。药理学研究发现菟丝子、桂枝、茯苓具有抗炎[14]、利尿[15-16]、抗脂质过氧化及抗衰老等药理学作用，具有改善实验性心肌缺血的病变程度与范围、增加冠状动脉血流量与降低血管阻力的作用[17]。菟丝子性平、味辛甘，其滋补肝肾有阴阳双补之功效，温而不燥、补而不滞，益精明目。茯苓味甘，有渗湿健脾之效。桂枝性温、味甘辛，有温中补虚、健脾利水、温阳通脉的功效。

3.3 中西医结合治疗CNV 的优势

本研究中，TLR-4/ NF-κB/IL-6 信号通路的激活促进了实验性CNV 的形成。中药组、西药组和联合组均有抑制CNV 的作用，其中联合组的抑制作用最强。高表达的VEGF 具有通过正反馈调节进一步激活PI3K/AKT 信号通路的作用，各治疗组通过对VEGF 表达的抑制，理论上可以抑制这一正反馈调节作用。TLR-4/NF-κB 通过激活IL-6，促进新生血管生成；激活的IL-6 又可以正性调控PI3K/AKT 信号通路的激活。中药组对IL-6 的表达具有显著的抑制作用，且效果优于西药组和联合组，加减驻景方可能通过降低IL-6 的表达，进一步降低了PI3K/AKT信号通路的激活。加减驻景方可能通过多靶点，发挥了抑制CNV 的作用。有研究发现，玻璃体腔注药术所导致的纤维化可以造成体内IL-6 水平的升高[18]，在本研究中，RT-qPCR 与Western blotting 的结果显示西药组与联合组的IL-6 表达量均高于中药组，这或许与玻璃体腔注射操作有关。

本研究中，各治疗组均有抑制TLR-4/NF-κB/IL-6 信号通路活性的作用。加减驻景方通过降低TLR-4/ NF-κB/IL-6 信号通路活性，发挥了抑制CNV 形成的作用，这可能与方药中多种药物的抗炎作用有关。