兔眼蓝莓幼果内生真菌多样性及其抑菌活性鉴定

张 林 侯 瑞 罗妮星 潘秋梅

（贵州大学林学院，贵州 贵阳 550025）

蓝莓又称越橘，杜鹃花科越橘属多年生落叶或常绿灌木，具有很高的经济价值和开发前景[1-2]。同时，蓝莓也是一种生物活性显著的药用植物，其茎叶中含有黄酮类、酚类和鞣质类等天然的活性成分[3]。近年来，贵州省蓝莓栽种面积不断扩大，随之而来的病害问题也日趋突出[4]。由尖孢镰菌（Fusarium oxysporum）引起的蓝莓根腐病，蛇孢腔菌属（Ophiobolus）真菌引起的茎枯病已成为贵州省栽培蓝莓急需解决的重要问题[4-5]。

植物内生真菌是在其生活史或生活史中某一段时间生活在植物组织内，但不会引起植物组织明显病害症状的真菌，其广泛存在于不同地域、不同种类的植物组织内[6]。宿主为内生真菌提供生长所需的营养物质，内生真菌则可促进宿主生长[7]，提高宿主对病虫害、环境胁迫等方面的抗性[8-9]。有些植物内生真菌还可以产生丰富的代谢产物，这些代谢产物同样可增强宿主的生长、提高宿主抗干旱能力和增加宿主对病虫害的抵抗能力[10-13]，还可以产生一些重要的抗人类疾病的次生代谢产物[14]。近年来，已经有很多关于利用内生真菌防治植物病害的报道。Hanada等曾报道7个内生真菌菌株，鉴定为弯孢霉属（Curvularia），镰孢菌属（Fusarium），拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）和弯颈霉属（Tolypocladium），这7个内生真菌菌株能够有效的防治由Phytophthora palmivora引起的可可的黑荚病[15]。Miles等同样筛选到对马铃薯晚疫病原菌（Phytophthora infestans）有防治效果的内生真菌，属于球毛壳属（Chaetomium）[16]。陈肖学等从野生蓝莓叶片中分离得到一株杂色曲霉（Aspergillus versicolor），对棉花枯萎菌（Fusarium oxysporiumf.sp.vasinfectum）等5种植物病原菌抑制效果较好[17]。张维瑞等[18]从杜仲（Eucommia ulmoides）叶片和果实分离得到11个菌株对4种病原菌具都有抑制作用，因此，利用植物内生真菌进行蓝莓病害防治将成为蓝莓病害生物防治的重要部分。

目前，蓝莓内生真菌研究主要集中于根部、茎部和叶部[19-20]。贵州省栽培蓝莓内生真菌研究还未见报道，果实内生真菌的分离也未见报道。本研究从贵州栽培的兔眼蓝莓（Vaccinium ashei）幼果中分离内生真菌，筛选具有抑菌活性的菌株，为下一步筛选活性物质，用于生物制药和病害生防产业提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 植物材料

供试兔眼蓝莓幼果采自贵阳省麻江县有机蓝莓园（东经107°42′06″、北纬26°24′45″），选取5～7年生健康兔眼蓝莓树上的幼果，供分离内生真菌使用。

1.1.2 植物病原真菌

6种供试植物病原真菌为禾谷镰孢菌（小麦赤霉病病原菌Fusarium graminearum）、尖镰孢菌（玉米茎腐病病原菌F.oxysporum）、轮枝镰孢菌（玉米穗腐病病原菌F.verticillioide）、尖镰孢菌（蓝莓根腐病病原菌F.oxysporum）、尖孢炭疽菌（辣椒炭疽病病原菌Colletotrichum acutatum）和齐整小核菌（白绢病病原菌Sclerotium rolfsii）。病原真菌均保存于贵州大学林学院森林病理实验室。

1.2 研究方法

1.2.1 蓝莓幼果内生真菌的分离培养

利用组织分离法，选取表面健康无病斑的兔眼蓝莓幼果，清水洗去表面污垢后晾干。在超净工作台中，用75%乙醇中浸2～3 s，无菌水冲洗3～5次，然后转入体积分数为3%NaClO溶液消毒3 min，无菌水冲洗3～5次，75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗5～8次，用无菌滤纸吸干水分后放置于PDA培养基中，每皿放置5颗蓝莓幼果，重复20个皿，25 ℃进行黑暗培养3～5 d；同时，采用植物组织印记法，将表面消毒的蓝莓幼果直接在培养基表面轻抹，相同条件下培养5个皿作为对照。利用真菌菌落边缘挑取法，挑取PDA平板培养基中生长形态差异典型的真菌菌株转接至新的PDA培养基，25 ℃恒温培养箱培养，纯化3～5次。

1.2.2 内生真菌鉴定

内生真菌DNA的提取采用CTAB提取法[21]。利用通用扩增引物ITS1和ITS4鉴定内生真菌，扩增菌株核糖体DNA内部转录间隔序列。内生真菌rDNA-ITS区段的PCR扩增、产物纯化参考王娜等[22]的方法。PCR扩增产物直接送测试公司切胶、纯化和测序。内生真菌的测序片段修正后利用NCBI数据库中blastn对测序序列进行对比分析。内生真菌分离率（IR）、多样性指数Shannon-Wiener diversity index（H）、真菌均匀度指数Pielou’s index（J）和丰富度指数Margalef’s index（R）分析蓝莓幼果真菌多样性[23]。

式中：F为分离总菌株数；Z为培养组织块数；Pi=Ni/N，Ni为属i的单菌落数量，N为菌株数量之和；S为分类单元，为属（种）i所在所有内生真菌中属（种）的数目[23]。

1.2.3 抑菌活性鉴定

采用平板对峙法测定各分离内生真菌菌株对6种植物病原真菌的抑菌活性。在无菌条件下，利用打孔器（6 mm）选取活化于PDA平板中的内生真菌菌株和病原菌菌落边缘打菌饼，分别接种于90 mm PDA平板两侧，使得分离菌株和病原菌接种点直径相距50 mm，只在平板右侧接种病原菌为对照（CK）。设置3个重复，放置于28 ℃恒温培养箱中培养7 d。测量CK病原菌菌落直径和处理组病原菌菌落直径，计算抑制率。

1.2.4 数据分析

蓝莓幼果内生真菌多样性指数H、J、R采用Excel 2010软件进行统计和分析。抑菌率采用Excel 2010和DPSv 17.10软件进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 蓝莓幼果内生真菌种类鉴定

由表1可知，利用组织分离法共分离获得具有明显菌落形态差异的真菌25株。通过菌株rDNA-ITS序列进行blastn比对，将25株菌株划分为12个属19个种，相似度为97%～100%，同源性非常高（表1）。其中，间座壳属（Diaporthe）5种、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）2种、裂褶菌属（Schizophyllum）2种、烟管菌属（Bjerkandera）2种，叶点霉属（Phyllosticta）、篮状菌属（Talaromyces）、拟茎点霉属（Phomopsis）、多节孢属（Nodulisporium）、葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）、青霉属（Penicillium）、炭垫菌属（Nemania）和蜡孔菌属（Ceriporia）各1种（图1）。25株蓝莓幼果内生真菌中，间座壳属分离得到的菌株数量最多，为蓝莓幼果内生真菌群落的优势属，占菌株总数的20.0%。拟盘多毛孢属和叶点霉属次之，均占菌株总数的16.0%。篮状菌属、裂褶菌属和烟管菌属均占菌株总数的8.0%。拟茎点霉属、多节孢属、葡萄座腔菌属、青霉属、炭垫菌属和蜡孔菌属只分离得到1株，各占总菌株数的4.0%（表1）。

表1 分离麻江兔眼蓝莓幼果期内生真菌的rDNA-ITS序列相似性分析Table 1 Similarity analysis of partial rDNA-ITS sequences from endophytic fungal isolates from the young fruit of V.ashei in Majiang

图1 蓝莓幼果内生真菌不同属的菌落形态Fig.1 The colony morphology of endophytic fungi of different genera of the young fruit of V.ashei

2.2 蓝莓幼果内生真菌多样性

根据分离结果，从麻江县有机蓝莓园幼果共分离得到12属共25株内生真菌，分离频率为25%，H为2.287 0，R为3.417 3，J指数为0.920 3。

2.3 蓝莓幼果内生真菌的系统发育树分析

蓝莓幼果内生真菌分为3个分支（图2）：子囊菌门为一个分支，担子菌门有两个分支。担子菌门共有3属，Schizophyllum2株，Bjerkandera2株 和Ceriporia1株。Ceriporia lacerate（KY7 80653.1）与Bjerkandera adusta（KJ668570.1） 和Bjerkanderasp.PAB-2014（KM099498.1）支持率为69%，亲缘关系较远。子囊菌门有9属，其中，Diaporthe5个种和Phomopsissp.XZ-26（DQ 272500.1）亲缘关系较近，同为一个分支。Nemania、Nodulisporium、Pestalotiopsis3个属为同一分支，但Nodulisporiumsp.MF6246（AF201755.1）与Pestalotiopsis microspora（LC412112.1）和Pestalotiopsissp.LH62（HQ832806.1）支持率为58%，亲缘关系较远。Botryosphaeria、Phyllosticta、Talaromyces、Penicillium为同一分支，且Talaromycessp.DI16-143（LT558965.1）和Penicillium brefeldianum（KM013443.1）亲缘关系较近，支持率为100%。

2.4 内生真菌对6种植物病原真菌的抑制效果

蓝莓幼果内生真菌菌株G3、G4、G5、G6等25个菌株与6种植物病原真菌在PDA平板中对峙培养7 d后，抑制率如表2所示，25株菌株对6种植物病原真菌都有一定程度的抑制作用。其中，菌株G6对5种病原菌抑制率在40%以上，G18对4种病原菌抑制率在45%以上。菌株G6和G18均属于裂褶菌属真菌。对玉米茎腐病病原菌尖镰孢菌抑制效果最好的内生真菌为菌株G6和G4，抑制率达到48%；对玉米穗腐病病原菌轮枝镰孢菌抑制效果最好的为菌株G18和G6，抑制率达到54%；对小麦赤霉病病原菌禾谷镰刀菌抑制效果最好的为菌株G5和G13，抑制率达到40%；对蓝莓根腐病病原菌尖镰孢菌抑制效果最好的为菌株G18和G17，抑制率达到46%；对辣椒炭疽病病原菌尖孢炭疽菌抑制效果最好的为菌株G18和G6，抑制率达到56%；对白绢病病原菌齐整小核菌抑制效果最好的为菌株G6和G18，抑制率达到76%；其中，菌株G4为间座壳属真菌，G5和G17为拟盘多毛孢属真菌，G13为多节孢属真菌。

图2 基于rDNA-ITS序列同源性的蓝莓幼果内生真菌系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of fungal isolates from the young fruit of V.ashei based on rDNA-ITS sequences

表2 麻江蓝莓幼果期内生真菌对6种病原真菌抑制效果Table 2 The inhibition effects of endophytic fungi on 6 pathogenic fungi from the young fruit of V.ashei in Majiang

3 结论与讨论

有关蓝莓内生真菌、蓝莓果实内生真菌的报道较少。了解蓝莓幼果内生真菌多样性对贮藏期病害的早期防控和丰富蓝莓内生真菌多样性具有重要意义。

本研究从健康兔眼蓝莓幼果期分离得到的内生真菌，主要隶属于子囊菌门和担子菌门，包括间座壳属真菌（20.0%），拟盘多毛孢属（16.0%），裂褶菌属（8.0%）、青霉属（4.0%）、炭垫菌属（4.0%）和蜡孔菌属（4.0%）等。其中，间座壳属（Diaporthe）、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)和葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）真菌为蓝莓叶部和茎部常见的植物病原真菌[24-26]。烟管菌属（Bjerkandera）目前在生防中应用较多，对柑橘炭疽病和油菜核盘菌都有很好的生防效果[27-28]。篮状菌属对桃褐腐病有抑制作用[29]。蜡孔菌属（Ceriporia）防治茄子棉疫病具有较好效果，且有一定的促生效果[30]。Li等分离云南省樟叶蓝莓的茎、叶和果实内生真菌，共得到25属内生真菌，果实组织中共分离得到7个属，全部为子囊菌门真菌，包括附球菌属（Epicoccum）、刺盘孢属（Colletotrichum）、拟盘多毛孢、枝孢属（Cladosporium）、Coleophoma、Ceuthospora和Coleophoma[31-32]。刺盘孢属能够侵染越橘属果实[33]。兔眼蓝莓和樟叶蓝莓果实内生真菌都分离得到了拟盘多毛孢属，樟叶蓝莓果实中并没有分离得到担子菌门真菌，但有报道发现担子菌门真菌可以通过降低营养物的释放来增加越橘属植物的生长[34]。本研究分离得到担子菌门共有3属，其对蓝莓果实的功能需后期进一步研究。

本研究利用平板对峙法检测了蓝莓内生真菌对6种植物病原真菌的抑菌活性，目的是筛选抑菌效果明显的真菌，丰富生防真菌资源。结果显示菌株G6对5种病原菌抑制率在40%以上，G18对4种病原菌抑制率在45%以上。菌株G4和G6对玉米茎腐病病原菌尖镰孢菌抑制效果；菌株G6和G18对轮枝镰孢菌、尖孢炭疽菌和齐整小核菌抑制效果最好；菌株G5和G13对禾谷镰孢菌抑制效果最好；G18和G17对蓝莓根腐病原菌尖镰孢菌抑制效果最好。其中，G6和G18为裂褶菌菌，菌株G4为间座壳属真菌，G5和G17为拟盘多毛孢属真菌，G13为多节孢属真菌。裂褶菌属通常可以分泌木质素降解酶，常用于工业废水脱色[35]，间座壳属和拟盘多毛孢属真菌为常见的植物内生真菌和病原真菌[36-37]，多节孢属真菌多见于内生真菌[38]。后期将进一步研究生防效果较好的内生菌株次生代谢产物及其对病原真菌的抑制作用，为筛选具有生物防治功能的内生真菌提供参考。