间充质干细胞在克罗恩病治疗中的应用研究进展

张义宝，钟继红

1 浙江中医药大学第二临床医学院，浙江杭州310053；2 浙江中医药大学附属第二医院

克罗恩病（Crohn’s disease，CD）是炎症性肠病的一个亚型，主要病理特征为消化道黏膜跳跃性病变、透壁性炎症及非干酪性肉芽肿［1］。近年来，我国CD 发病率呈增长趋势，15～25 岁青壮年好发，主要临床表现为腹痛、腹部包块、腹泻、体质量下降等，部分患者可出现皮肤、关节病变及贫血等；此外，以肛周瘘管为首发症状的CD 患者逐渐增多，病情严重的患者会出现肛周疼痛、肛周瘘管脓性分泌物渗出、大便失禁等症状，严重影响患者生活质量［2］。目前，CD 的发病机制尚未统一，但多数研究认为CD 的发病主要与遗传、环境、感染、肠道菌群及免疫等因素有关。环境因素造成遗传易感群体在肠道菌群介导中出现肠道异常免疫应答，使肠道出现免疫侵损与炎症发生发展的过程，亦由于患者免疫调节失衡和（或）持续性受到特异抗原调控，最终导致CD［3］。目前临床尚无特异性CD根治方法，主要采用5-氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂等药物控制疾病活动，延缓疾病进展。但随着患者疾病活动度的进展，药物治疗的效果减弱，患者易出现过敏、耐药等不良反应。寻找新的CD 治疗方案具有重要临床意义。最新研究发现，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治疗 CD 具有一定效果，但其具体治疗机制、疗效及安全性不明。现重点将MSCs在CD治疗中的应用情况综述如下。

1 MSCs的生物学功能

MSCs 具备自我更新、多向分化与免疫调节性能，可作为促进组织再生的关键种子细胞，定向分化成成骨、软骨、内皮、脂肪等不同功能组织细胞［4］。由于MSCs生物特征多样性，MSCs可用于组织修复、再生、抑制物预防宿主病、自身免疫性疾病、抗炎症治疗等方面。

1.1 MSCs的极化 炎症状态下的微环境差异可介导 MSCs 发生极化，并且与 M1 型、M2 型巨噬细胞雷同。MSCs 极化后分为促炎型MSC1 与抗炎型MSC2。组织侵损时侵损部位可大量分泌炎症因子，介导巨噬细胞分化为M1 型巨噬细胞，加重炎症反应，大量分泌干扰素γ（INF-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子，导致MSCs 分化为抗炎型MSC2，调控一氧化氮、吲哚胺2，3-双加氧酶的产生，发挥抗炎作用，降低组织损伤程度［5-6］。MSCs 极化后具有抑制与增强免疫的双重效果。将MSC1 与肿瘤细胞共同培养时，MSC1 可抑制肿瘤细胞的增殖、降低肿瘤细胞迁移，而MSC2 可促进肿瘤细胞的生长与增殖［7-8］。

1.2 MSCs的归巢 干细胞“巢”作为干细胞生存的微环境，可介导干细胞的生物学行为，维持干细胞生长、分化与更新平衡性。MSCs 归巢是MSCs 在血管内皮管壁中游离，并粘附在内皮细胞表层中，受血管内皮影响而穿透内皮细胞达到目标靶组织［9］。MSCs归巢数目量对组织增殖、凋亡、迁移影响明显，但具体作用机制目前尚不明确。有研究［10］推测，MSCs 归巢可能与MSCs 表面表达的趋化因子、黏附分子及生长因子等因素有关。目前由于转基因技术的不断发展，强调可将病毒或质粒作为载体携带有益基因提高MSCs的归巢效率和治疗能力。

2 MSCs在CD治疗中的应用

2.1 MSCs 治疗 CD 的作用机制 MSCs 治疗 CD 的作用机制可能与免疫调节、极化、归巢、TLRs受体激活、组织修复与免疫原性低下等因素有关。

MSCs 的免疫作用是多环节共同作用的结果，MSCs 可通过调节干扰素、TNF-α、白细胞介素6（IL-6）等炎症信号通路极化从而抑制炎症反应。极化的MSCs 可分泌大量免疫抑制可溶性因子调控T、B 细胞的分裂复制分化，影响肥大细胞的活化，延缓树突状细胞成熟聚集Treg 细胞，让未成熟的树突细胞发生转为调节性树突细胞，使炎性M1 型巨噬细胞转化成为免疫调节作用的M2型巨噬细胞。MSCs能分泌胞外囊泡（EVs），有研究［11］报道，MSCs 外囊泡（MSC-EVs）具有与MSCs类似的免疫调节功能，它能促进单核细胞分化为M2型巨噬细胞，抑制T细胞的激活、增殖，降低细胞因子的产生，从而更有利于MSCs发挥免疫调节作用。MSCs还可大量分泌具有细胞交流作用的外泌体，促进淋巴细胞形成、炎症因子活化释放，发挥对异常免疫系统的调节作用。体外研究［12］发现，MSC 的表型及功能在治疗 CD 时不受普通药物浓度影响，MSC 联合常规调节免疫药物、抗炎药物治疗CD 效果更好。此外，CD 患者TLRs受体的激活有利于维持慢性炎症状态，同时也作用影响MSCs 免疫调节、极化、归巢功能，有利于充分发挥MSCs 治疗效果。令人感到意外的是，凋亡的MSCs也具有免疫抑制作用［13］。

MSCs在游离迁移时可修复损伤的肠道组织，作用分化为肠上皮肌成纤维细胞，大量分泌修复因子促进肠上皮细胞的增殖、分化，而保护肠道黏膜。

2.2 用于CD 治疗的MSCs 来源 目前用于CD 治疗的MSCs 主要来源于脂肪组织、骨髓及脐带血。与骨髓间充质干细胞比较，脂肪组织、脐带血中的MSCs免疫抑制功能更强。脂肪源性MSCs具有最低的免疫原性［14］，由于CD 患者IL-1β 分泌使肠系膜脂肪源性干细胞免疫抑制特性降低，激活了脂肪源性干细胞的免疫反应，因此具有最佳免疫抑制作用的脂肪源性MSCs 可能是治疗CD 患者的最好选择。欧盟批准的异体扩大脂肪源性MSCs 是首个用于治疗非活动性或轻度活动性腔内CD 成年患者复杂肛瘘的 MSCs 疗法［15］，该源性 MSCs 疗效和安全性在多个临床试验中得到了验证。无论是自体还是同种异体的 MSCs 均对 CD 有一定的疗效，但有研究［16］报道在利用MSCs 治疗49 例CD 患者中，同种异体MSCs治疗比自体MSCs 治疗效果更好。自体MSCs 在溃疡性结肠炎、CD及系统性红斑狼疮治疗中的效果有待提高，可能与同种异体的MSCs 稳定性更好有关，且由于MSCs只低水平表达HLA I类抗原，而缺乏表达HLA II 类抗原，因此同种异体MSCs 移植时并不需要考虑免疫排斥反应，这使同种异体MSCs 应用范围更加广泛。除了以上三种主要来源的MSCs，Zibandeh 等［17］体外研究报道了人牙滤泡间充质干细胞（DF-MSCs）能显著减少 CD 患者炎症组织 T 细胞数量，诱导产生Tregs，降低免疫反应，这为MSCs 治疗CD提供了一个重要的潜在来源。

2.3 MSCs用于治疗CD的适应证、禁忌证 欧洲血管和骨髓移植组归纳的MSCs 在自身免疫性疾病中的常见适应证为多发性硬化症、系统性硬化症及CD［18］。MSCs 适用于糖皮质激素、免疫抑制剂与生物制剂等治疗效果有限时的重症克罗恩病或合并肛瘘者，尤其是对于复杂难治性肛瘘CD 患者，MSCs治疗是一种很有前景的方法。手术治疗或具有手术禁忌证患者并不适用于MSCs 治疗。应用MSCs 治疗前需判断CD 的疾病状态，同时应注意患者出现腹腔、盆腔脓肿或其他感染的可能。

2.4 MSCs 用于治疗CD 时剂量 目前，临床对MSCs 治疗CD 的剂量与疗程没有统一标准。Dhere等［19］利用自体骨髓 MSCs 在 12 名克罗恩病患者中进行首个Ⅰ期安全临床试验，设置了2、5 或1000 万个细胞/kg 的输注梯度，发现所有患者耐受性良好，未见剂量依赖毒性，单次静脉注射剂量1000万细胞/kg是安全可行的。ALVARO-GRACIA 等［20］研究发现，初始治疗时剂量为2 000万单位MSCs时，CD合并肛瘘患者体内未观察到临床应答，治疗8 周时再次追加剂量2 000 万，最终患者肛瘘封闭，但此次应用计量涉及样本量较小，尚缺乏多中心大样本验证。

2.5 MSCs用于治疗CD 时的应用方式 MSCs 治疗CD方式有静脉输注、局部注射、肠系膜上动脉注射、股动脉注射等。静脉输注是现阶段抑制MSCs 的最理想方式，尤其是针对CD 合并肛瘘、直肠阴道瘘的患者，可便于MSCs 在可吸收基质中附着，促进对病灶组织的修复作用，且操作便捷；肠系膜上动脉注射、股动脉注射等均为有创性操作，增加感染及并发症风险；局部注射单纯针对局部位置的病灶具有良好效果，但治疗全身性炎症效果一般。在局部输注MSCs治疗肛瘘CD 时，MOLENDIJK 等［21］强调为了避免MSCs 的浪费，达到规范化治疗目的，应将MSCs注射至瘘管内部开口周围的管壁而非瘘管腔内。因MSCs 注射后会被肺部吸收，造成CD 肠道炎症位置可吸收剂量减弱，所以对治疗效果有一定的影响。孙辉等［22］对溃疡性结肠炎小鼠采用不同注射MSCs方式治疗，然后发现心脏注射模式治疗效果优于尾静脉注射；DAVE 等［23］利用超声将人骨髓 MSCs 从左心室注入CD 小鼠体内，提高了MSCs 输往炎症部位的成功率，极大地降低了小鼠发病率和死亡率。但此方式对临床患者治疗方式的选择而言仅具有一定参考价值，并不适用。

2.6 MSCs 治疗CD 的疗效和安全性 不论是体外研究还是临床Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期试验均表明MSCs治疗CD疗效较好。XIE 等［24］体外研究结果显示脂肪源性MSCs和骨髓源性MSCs均能提高CD小鼠IL-10的表达，减少炎症因子生成，抑制炎症反应，两者疗效类似。MSCs不仅对活动性CD有效，还对CD相关性肠纤维化起作用。LIAN 等［25］体外研究报道了骨髓MSCs通过免疫调节作用能够治疗CD小鼠肠道纤维化，降低肠道梗阻的发生率。

在最近几年的Ⅰ期临床试验中，证实MSCs 治疗CD 合并肛周瘘管患者是安全有效，DOZOIS 等［27］和 LIGHTNER，AMY L 等［28］人分别报 道 了自体MSCs对经括约肌隐腺瘘和直肠阴道瘘CD患者治疗安全有效［27-28］。在Ⅱ期临床试验中，GREGOIRE等［29］表明 MSCs 治疗腔内 CD 在短期是安全有效，但为了更好地设计临床试验，后续还需要更多的体外试验。在更高级别的Ⅲ期临床试验中，PANÉS 等［30］完成的一项3 期多中心随机双盲对照临床研究有力证明了异体扩大脂肪来源的间充质干细胞（Cx601）治疗肛周瘘管CD 是有效和安全的。此外GARCIAOLMO 等［31］人 完 成 异 体 扩 大 脂 肪 来 源 的 MSCs（Cx601）治疗CD 患者复杂肛瘘的3 期临床试验后，又同样利用Cx601 治疗CD 患者复杂肛瘘进行了另外一项临床试验，不同的是此次临床研究将观察时间延长至第52周，与标准治疗相比，Cx601治疗效果更佳，至第52周时患者复发率更低。在最高级别的研究证据中，国内外多位学者［32-35］在不同年份对MSCs 治疗肛瘘CD 患者进行了META 分析，均证实MSCs对肛瘘CD患者有效，无与MSCs直接相关的不良事件增加，且无论是自体还是同种异体MSCs 移植，脂肪、骨髓、胎盘来源的MSCs 治疗CD 肛瘘均安全有效，与骨髓间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞具有更低的复发风险。

上述研究均只是单纯应用MSCs 治疗CD，目前有许多研究证实MSCs 联合其他治疗方式会增强疗效。抗细胞因子药物联合骨髓MSCs 治疗有助于减少CD 患者单纯肛瘘复发率，延长瘘管持续关闭时间［26-37］，并且 KNYAZEV 等［38］还报道了硫唑嘌呤（AZA）联合骨髓MSCs 治疗CD 具有更强的抗炎作用。WAINSTEIN 等［39］人的长期随访研究表明脂肪MSCs 联合富血小板血浆及直肠内推进皮瓣对复杂肛瘘CD 具有较好治疗效果。因此在临床上可以适当联合抗细胞因子、硫唑嘌呤等制剂治疗CD患者。

总体认为，MSCs治疗CD短期内具有安全性，几乎未见不良反应或严重不良反应，但长期临床安全性由于研究数据不足所以难以定论，这需要未来长期随访研究。目前最长的研究周期为BARNHOORN等［40］为期4 年的临床研究，结果表明同种异体骨髓MSCs治疗肛瘘CD患者长期安全有效。因干细胞中具备活化癌基因细胞的肿瘤特征，同时在细胞传代期间具有分化风险，所以MSCs 移植后存在诱发肿瘤的危险。但有研究［41-42］指出，MSCs 移植后患者会在短时间中出现低热的情况，但并未观察到组织异位增生存在，而现有临床资料中也并未有CD 患者采用MSCs治疗后并发肿瘤的案例报道。

综上所述，MSCs移植治疗可延缓CD病情进展，改善患者生活质量，促进肠黏膜的恢复，且几乎未见不良事件。但由于MSCs 治疗CD 仍然在试验阶段，尚需多中心、大样本、随机双盲研究，现阶段仍有一些问题丞待解决，如MSCs最理想来源、CD患者适应证，最理想移植方式、治疗次数及疗程、治疗后肠道菌群变化、治疗后无效如何处理、治疗后病情复发或加重是否继续维持MSCs 治疗等等都需在日后临床试验中深入探讨。