中医药干预对帕金森病细胞凋亡影响的研究进展

李伦甘，胡玉英

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD) 是一类椎体外系疾病，由于黑质多巴胺(Dopamine，DA)能神经元显著变性死亡，黑质-纹状体DA能通路变性，纹状体DA递质水平显著减低而导致PD患者肌张力增高、动作减少等运动症状的产生。黑质DA能神经元变性死亡是多因素交互作用的结果，许多研究表明细胞凋亡是DA神经元死亡的主要方式[1]。而目前PD的治疗以对症治疗为主，主要针对DA减少及功能丧失问题，仅能一定程度缓解临床症状，副作用大且缺乏长期疗效，而在PD早期保护神经元，抑制细胞变性和凋亡，将有助于延缓PD的进展。中医药多靶点作用提供了广泛神经保护作用，在抗细胞凋亡上具有独特优势，现将中医药在抗PD细胞凋亡的研究进展综述如下。

1 PD细胞凋亡机制

细胞凋亡是细胞在多细胞生物体内一种自主有序的死亡，对维持机体组织稳态、器官形态形成发育、受损细胞清除和防御感染至关重要[2]。细胞凋亡受多种基因严格调控，维持正常生命活动，一旦调控失衡，神经元细胞过度凋亡，将会导致神经变性疾病(如PD等)的发生。

1.1 细胞凋亡过程 细胞凋亡过程受基因精确调控，在凋亡信号刺激下，细胞接受凋亡信号，经复杂生化反应完成信号转导，激活凋亡基因，并合成各种促凋亡蛋白酶类，使细胞结构分解、死亡，而后被巨噬细胞分解，完成凋亡。许多基因参与细胞凋亡过程，包括B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)基因家族、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)受体超家族、凋亡蛋白抑制剂、P53基因等。Bcl-2家族是一类重要的凋亡调控基因，分为抗凋亡基因(如 Bcl-2、Bcl-1、Bcl-xL等)和促凋亡基因(如Bax、Bak、Bad、Bid 等)两大类[3]。凋亡级联反应的早期阶段主要取决于 Bcl-2 家族促凋亡和抗凋亡蛋白之间的平衡[4]。而Caspase家族的活化是细胞凋亡的中心环节，通过裂解细胞功能蛋白和结构蛋白使细胞分解以致凋亡，其包括凋亡启动因子(Caspase-2、8、9、10)和凋亡执行因子(Caspase-3、6、7)，Caspases的激活常常作为细胞凋亡的标志[5]。细胞凋亡途径包括：线粒体介导途径(内源性途径)、死亡受体途径(外源性途径)。线粒体介导途径即细胞在凋亡刺激因子诱导下，线粒体外膜构象改变，通透性增加，导致细胞色素C(Cytochrome c，Cyto c)等释放至胞浆内，激活凋亡蛋白酶活化因子-1(Apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1)并活化Caspase-9，形成由Cyto c、Apaf-1、Caspase-9组成的凋亡小体，激活Caspase-3，最终导致细胞凋亡。死亡受体途径即在细胞外凋亡信号诱导下，死亡受体(如TNFR1、CD95、DR3等)与相应死亡配体(如TNF、CD95L和 Apo-3等)结合，并通过其膜内的死亡结构域(Death domain，DD)募集衔接蛋白，衔接蛋白经其死亡效应域(Death effector domain，DED)与Procaspase-8形成死亡诱导复合物(Death-inducing signaling complex,DISC)，激活Caspase-8，引发Caspase级联反应而导致细胞凋亡[6]。

1.2 细胞凋亡与PD相关性 细胞凋亡是PD患者黑质DA能神经元死亡的主要方式，这从PD患者尸检报告显示DA能神经元中DNA断裂和凋亡染色质变化，以及凋亡相关蛋白水平表达升高得到了证实[7]。此外，在PD细胞模型中，抗凋亡蛋白(如 Bcl-2)的过度表达可抑制DA能神经元死亡[8]，以及Caspase抑制剂可以挽救神经元的死亡[9]进一步支持了这一观点。细胞凋亡在神经性疾病中被进行了广泛的研究，线粒体介导的凋亡被证实是PD细胞凋亡的主要途径。例如，许多机制包括线粒体DNA缺失、核DNA突变、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)过度积累等导致的线粒体功能障碍触发了PD的细胞凋亡[10]。又如一些与线粒体功能相关的基因突变，包括Parkin、LRRK2、PINK1 和DJ-1的突变，可导致常染色体遗传性PD的发生[11]。因此，干扰或抑制凋亡途径是防止DA能神经元丢失及PD发病的一种有效治疗策略。

2 PD细胞凋亡的中医药干预

中医药强调整体治疗，作用机制复杂，中药多成分的特点使中药治疗具有多途径、多靶点作用。过去10年的PD体外模型研究中，无论是中药单药、中药复方还是针灸治疗，在抗PD细胞凋亡方面取得了显著的成果。

2.1 单味中药治疗 在采用单味中药干预MPP+诱导的PD体外模型-SH-SY5Y细胞或MES23.5细胞模型的研究中，钩藤提取物(Uncaria rhynchophylla extract,URE)能呈剂量依赖性增加SH-SY5Y细胞的细胞活力，并通过提高Bcl-2、P-ERK等抗凋亡蛋白表达，降低Bax表达,进一步逆转细胞凋亡[12]。葛根素通过升高了MDM2和Bcl-2 的mRNA的表达水平，抑制P53、Bax及Caspase-3 的mRNA的表达，发挥了对SH-SY5Y细胞的保护作用[13]。管花肉苁蓉纳米颗粒(肉苁蓉成分)能改善MES23.5DA能神经元细胞毒性，增加酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)及Bcl-2表达，抑制Bax表达，减少DA能神经元细胞凋亡[14]。而在采用鱼藤酮制备的PC12细胞或SH-SY5Y细胞模型研究中发现，虫草素(北冬虫夏草成分)能明显提高PC12细胞的存活率，其机制主要是通过下调Caspase-8及Fas蛋白的表达，从而抑制Caspase-3的激活，减少PC12细胞凋亡[15]。白藜芦醇(虎杖成分)通过激活去乙酰化酶SIRT1抑制P53表达，从而抑制细胞凋亡和增强神经元存活[16]。研究表明，芍药苷可以通过调节线粒体膜电位以及提高Bcl-2表达水平、降低Bax表达水平，对PC12细胞凋亡发挥神经保护作用[17]。此外，在6-OHDA诱导的PC12细胞模型的研究中发现，枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)可显著逆转PC12细胞活力下降，减缓ROS和一氧化氮的积累，降低细胞内游离Ca2+，通过其抗氧化作用以剂量依赖的方式降低凋亡细胞的百分比[18]。在采用MPTP诱导PD小鼠模型研究中，不同剂量人参皂苷Rg1(人参成分)预处理可以下调PD小鼠黑质中Caspase-3的表达，上调Bcl-xL的表达，抑制黑质神经元凋亡[19]。另外，在何首乌相关研究中发现，其提取物(2,3,5,4′-Tetrahydroxystilbene-2-0-β-D-glucoside，TSG)既可以通过抑制ROS生成和调节JNK和PI3K/Akt通路的活化抑制PC12细胞凋亡[20]；也可以显著上调Bcl-2/Bax比值，逆转Cyto c释放，抑制Caspase-3活化[21]，进而对MPP+诱导的PC12细胞或SH-SY5Y细胞发挥神经保护作用。

2.2 中药复方治疗 由于PD的病因病机复杂多样，单味中药神经保护作用具有局限性，而中药复方能明显弥补其不足。中药复方在融合多种药物疗效基础上发挥多靶点作用，治法上多以补益肝肾法、平肝熄风法、活血化瘀法为主，疗效显著。

2.2.1 补益肝肾法:在采用6-OHDA诱导的PD 大鼠模型中，复方地黄方预处理既可通过调控GSK3β信号通路，缓解下游蛋白激活，减弱α-突触核蛋白 (α-Synuclein，α-syn)异常聚集和错误折叠，抑制细胞凋亡[22]，也可以通过激活PI3K/Akt信号通路呈剂量依赖性降低Bax蛋白表达，减少细胞凋亡指数[23]。在采用MPTP诱导的PD小鼠模型研究中，加减地黄饮子汤可以减少TH的丢失，有效改善小鼠的行为障碍，并通过调节线粒体和内质网通路中Caspase-12蛋白的表达，阻断细胞凋亡[24]。健脾益肾通络方则可以通过NF-κB通路降低Caspase-3 蛋白表达而抑制细胞凋亡[25]。补肾方苁蓉精也可通过调节Bcl-2和Bax蛋白，阻止磷脂酰丝氨酸的外化，预防MPP+所致细胞凋亡[26]。此外，补肾止颤方联合埋针治疗能使蛋白酶抑制因子(PSI)诱导的PD大鼠模型黑质中Bcl-2蛋白水平显著升高，Bax蛋白水平下降[27]。而柔筋止颤片能抑制ROS通路，减少凋亡蛋白Caspases蛋白的表达，从而抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡[28]。

2.2.2 平肝熄风法:前人研究发现，天麻钩藤饮能通过上调Bcl-2蛋白水平，减少Caspase-3激活，抑制鱼藤酮致SH-SY5Y细胞凋亡[29]。自拟控颤汤可以减少PD大鼠的旋转数，改善PD大鼠的旋转行为，并显著增加大鼠黑质TH阳性细胞表达数[30]。在采用6-OHDA制备PD大鼠模型研究中，龟羚帕安丸可以显著升高模型鼠中脑黑质中Bcl-2和Bcl-2/Bax的比值而发挥神经保护作用[31]。与此类似，敛肝熄风养血濡筋方也可以通过调节Bcl-2/Bax比值抑制PD模型细胞凋亡[32]。此外，银杏平颤方预处理可显著降低MPP+诱导的SH-SY5Y细胞模型凋亡率，且WB法检测PARP、PTEN的mRNA及蛋白水平均低于模型组[33]。

2.2.3 活血化瘀法:陈炜等[34]在采用鱼藤酮制备PD大鼠模型中，使用低中高剂量加味五虎追风散干预，结果发现与模型组比较，大鼠中脑黑质区α-syn含量均降低，TH含量均呈剂量依赖性升高，提示加味五虎追风散通过抑制α-syn寡聚体形成并增加TH含量，抑制DA能神经元凋亡。与此类似，陈松盛等[35]研究发现补肾活血方能通过抗氧化应激、提高TH水平抗细胞凋亡而对6-OHDA所致PD大鼠起保护作用。李双双[36]用鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞模型并用桃红四物汤干预，结果显示桃红四物汤能够下调SH-SY5Y细胞 Bax/Bcl-2、P53、Caspase-3的表达水平，同时上调p-ERK/ER，抑制细胞凋亡。

2.3 针灸治疗 近年来，针灸在抑制PD神经元细胞凋亡方面亦取得了一定的成效。吴成举等[37]探讨“双固一通”电针、头针两种不同方法对PD大鼠黑质神经元的影响，结果显示这两种不同的针灸方法均可以促进模型鼠DA的合成，改善大鼠运动障碍，并通过提高Bcl-2蛋白及降低Bax蛋白表达水平，发挥抗凋亡作用。陈亚丽[38]采用MPTP小鼠腹腔注射法制备PD模型，电针组使用100 Hz连续波每日或隔日治疗，WB检测结果提示100 Hz连续波电针治疗能通过抑制磷酸化JNK、P38信号通路的激活，调节Bcl-2/Bax比值，抑制Caspase-3激活而抗细胞凋亡。李静等[39]给予鱼藤酮诱导的PD大鼠电针“百会” “太冲”“三阴交”穴治疗后，实验室检测发现大鼠黑质中抗氧化酶SOD、GSH-Px含量高于模型组，TH免疫反应阳性细胞数增加，DA能神经元细胞凋亡率下降。与此类似，白妍等[40]也发现电针“百会”“太阳”穴能通过抑制PD大鼠黑质中Caspase-3表达，降低细胞凋亡水平。

3 讨论与展望

随着近年来PD神经保护治疗的兴起及现代微观药理学研究的进展，中医药在抗PD细胞凋亡的研究已进入到分子乃至基因水平。中药有效成分提取物及针灸治疗通过不同分子通路调控基因信号转导、靶点蛋白表达，在PD早期阶段阻止DA能神经元变性凋亡。但由于中医药作用机制复杂，目前对于抗PD细胞凋亡具体的作用靶点、介导通路、信号转导的研究仍存在着不全面、不系统等短板，中医药抗凋亡作用机制的研究亟待在未来中医药实验研究中进一步完善。