香樟叶肉含晶细胞季节变化研究

尤扬 赵明华 张晓云 王保全 郎冬梅 徐钧 齐玉杰 尚潜

摘 要：  為探讨香樟（Cinnamomum camphora）叶肉含晶细胞超微结构的季节变化，阐明香樟叶肉中草酸钙晶体在春夏秋冬的变化规律。该研究以多年生香樟（C. camphora）叶片为材料，分别于春夏秋冬四个季节露地取样，制作超薄切片，用透射电子显微镜（TEM）观察叶肉含晶细胞超微结构的变化。结果表明：春季时香樟叶肉中只有少数细胞有草酸钙晶体，数量较少，晶体结构多为柱状晶、方晶;夏季时香樟叶肉细胞中随机分布于液泡的草酸钙晶体明显比春季的数量多、体积大、形态丰富，晶体多为柱状晶、方晶、针晶、簇晶;秋季时香樟叶肉细胞草酸钙晶体和夏季的类似，数量较多，形态多样，以方晶和柱状晶针晶为主，伴有晶簇;冬季时香樟叶肉含晶细胞晶体形态为柱状晶、方晶、针晶，数量比夏季和秋季的数量略有减少。该研究结果表明在一年四季中香樟叶肉细胞液泡中均有草酸钙晶体结构存在。

关键词： 香樟， 含晶细胞， 草酸钙， 超微结构

中图分类号：  Q44.6

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2021）12-1974-07

收稿日期：  2020-06-13

基金项目：  河南省科技计划项目（162102110155）;新乡市科技创新发展专项（CXGG16029）;河南省教育厅科学技术研究重点项目（13A180307）;河南科技学院高层次人才科研启动项目;河南科技学院大学生创业实践计划项目（2019CY026） [Supported by Science and Technology Project of Henan Province（162102110155）; Special Project of Science and Technology Innovation and Development of Xinxiang （CXGG16029）;Key Project of Science and Technology Research of Henan Education Department （13A180307）; Launch Research Project for High-level Talents of Henan Institute of Science and Technology; Henan Institute of Science and Technology Student Entrepreneurship Practice Plan Project（2019CY026） ]。

作者简介： 尤扬（1973-），博士，副教授，硕士研究生导师，从事植物逆境生理及解剖结构等研究，（E-mail）youyang1028@126.com。

通信作者

Seasonal changes of crystal idioblasts in mesophyll of Cinnamomum camphora

YOU Yang1，2*， ZHAO Minghua3， ZHANG Xiaoyun1，2， WANG Baoquan1，2， LANG Dongmei1，2， XU Jun1，2， QI Yujie1， SHANG Qian1

（ 1. School of Horticulture Landscape Architecture， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China; 2. Henan

Engineering Technology Research Center of Characteristic Horticultural Plants Development and Utilization， Henan Institute of Science

and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China; 3. Forestry Workstation of Xinxiang， Xinxiang 453000， Henan， China ）

Abstract：  In order to explore the seasonal changes of the ultrastructure of crystal idioblasts in mesophyll of  Cinnamomum camphora， and to elucidate the changing law of calcium oxalate crystals in spring， summer， autumn and winter， in this study with C. camphora as test materials， samples were taken from the open field in the four seasons and ultra-thin sections were made and the ultrastructural changes of mesophyll crystal idioblasts were observed with a transmission electron microscope （TEM）. The results were as follows： Only a few mesophyll cells had calcium oxalate crystals in spring and the number was relatively small， which were mainly in shape of columnar crystals and square crystals;  Calcium oxalate crystals randomly distributed in the vacuoles of mesophyll cells in summer were obviously more in number， bigger in volume， and richer in morphology than those in spring， and the crystals are mostly columnar crystals， square crystals， needle crystals and cluster crystals; The calcium oxalate crystals of the C. camphora mesophyll cells in autumn were similar to those in summer， with a large numbers of  and various forms， mainly square and columnar needle crystals， accompanied by crystal clusters; The crystal form of C. camphora mesophyll crystal idioblast in winter was columnar crystals， square crystals and needle crystals， and the number was slightly less than those in summer and autumn. The crystal structure of calcium oxalate existed in the vacuole of C. camphora mesophyll cells throughout the year.

Key words： Cinnamomum camphora， crystal idioblast， calcium oxalate， ultrastructure

在植物界超过215科的植物中发现有草酸钙晶体，依据其形状特点可将草酸钙晶体分为柱晶、簇晶、针晶、方晶、砂晶5种常见类型（Lersten & Horner，2006;严巧娣和苏培玺，2006）。草酸钙的生理作用主要集中在解毒作用（Franceschi & Nakata，2005）、钙调节（Hudgin et al.，2003）、支持作用（Borchert，1986）、离子平衡（Volk et al.，2002）、防御功能（Volk et al.，2002）等方面。含晶细胞的晶体主要成分中占绝大多数的是草酸钙（Finley，1999）。植物中沉积草酸钙晶体的现象普遍存在，所有晶体来源均由环境中的钙与生物体自身合成的草酸所形成（Nakata et al.，2003）。草酸钙晶体大小和形态的多样性、空间分布及分布优势等，促成了许多有关植物细胞液泡内晶体功能的假说。事实上，含晶细胞在植物許多组织中都有发现，大部分聚集在特化的细胞及含晶细胞的液泡中（Nakata & Mccoonn，2003）。植物液泡中含晶细胞的存在可能暗示在某些方面具有重要的生理功能，这些功能与外界环境的变化可能有某些联系。

香樟（Cinnamomum camphora）为樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）常绿乔木，树体高大，可达50 m;叶卵状椭圆形，离基三出脉;圆锥花序;核果;花期5月， 果期9—11月（陈有民，2010）。香樟的研究大多集中在北引抗寒生理方面，自然降温胁迫中5种樟树抗寒性强弱为猴樟>芳樟>本樟>尾叶樟>沉水樟（王宁等，2014），用质量浓度为500 mg·L-1的多效唑（PP333）溶液喷布叶片能明显提高香樟幼树的抗寒性（尤扬等，2009）。盐胁迫方面，SNP的加入对酸铝胁迫下的香樟幼苗起到一定缓解作用且浓度在0.05～0.1 mmol·L-1之间缓解作用最大（李茹等，2017）。分子生物学方面，CcCBFa和CcCBFb均能被低温、干旱、盐及ABA强烈诱导（李勇鹏等，2016）。凋落物作用方面，香樟凋落叶分解初期可能释放了不利于土壤硝化过程的物质，造成土壤硝态氮匮乏（陈洪等，2016）。有关人工低温胁迫下香樟叶肉细胞中草酸钙结晶偶有报道（尤扬等，2018a，b），而香樟不同季节叶肉细胞中含晶细胞的研究未见报道。香樟叶肉细胞中草酸钙结晶可能在植物抗逆性，尤其是在抗低温胁迫方面有某种重要的暗示作用。

古有“樟不过江”的说法，如今，香樟的引种栽培已到达黄河南岸的郑州、三门峡等地，甚至北上到了黄河北岸的新乡。本研究以北引至黄河北岸的河南新乡多年生香樟为材料，在自然状况下，于不同季节分别对叶片取样，用透射电子显微镜拍照，研究其叶肉含晶细胞在一年之中不同季节的变化，以期在细胞学水平上阐明香樟叶肉含晶细胞中草酸钙的变化规律，为香樟的进一步北引及合理栽培奠定细胞学基础，也为研究香樟在北方栽培环境中季节变化对草酸钙结晶形态规律的影响提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和药品

超净工作台、LEICA EM UC7超薄切片机、HITACHI-HT7700型透射电子显微镜;4%戊二醛（pH为7.0）、pH为7.0的0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液（PBS）、1%四氧化锇固定液、梯度乙醇（50%、70%、80%、90%、95%、100%）、Epon812树脂、醋酸双氧铀染色液、柠檬酸铅染色液等。

1.2 材料和处理方法

材料为从河南信阳引种到河南新乡的多年生香樟截干苗木，干高3～3.5 m，胸径5～8 cm，作为行道树栽植于学校主干道两侧3 a。栽植地土壤碱解氮含量76.4 mg·kg-1，速效磷含量24.2 mg·kg-1，速效钾含量162.5 mg·kg-1，有机质含量0.68%，土壤容重2.17 g·cm-3，土壤pH值8.2～8.3。

参照李和平（2009）和尤扬等（2018b）的方法（有改动）制备超薄切片。2019年春季[3月20日，15 ℃（取样瞬时温度），下同]，当季平均温度为12 ℃），夏季（6月20日，29 ℃，当季平均温度为26.3 ℃），秋季（10月20日，20 ℃，当季平均温度为22.6 ℃）和2020年冬季（1月5日，-6 ℃，当季平均温度为9.3 ℃）的清晨7：00左右，随机选取三株香樟，每株香樟分别选3个正常的、当年生且南向外围枝条，取样于枝条顶端向下数第3片或第四片功能叶中脉中部左右0.5 cm处，横切（春季取样为新生叶片，略红色），分别用4%戊二醛进行前固定和1%四氧化锇进行后固定。经磷酸缓冲液漂洗、脱水、环氧树脂Epon812渗透、包埋、聚合后，用LEICA EMUC7型超薄切片机钻石刀切片（厚度50～70 nm），经柠檬酸铅-醋酸双氧铀双重染色，用HITACHI-HT7700型透射电子显微镜拍照，每个超薄切片样本拍照15个。

2 结果与分析

2.1 春季香樟叶肉含晶细胞的超微结构

如图1所示，所切部位为叶肉海绵组织，春季香樟叶肉细胞的细胞壁与质膜清晰可见。细胞核为圆球形，核仁清晰地位于细胞核的中央（图1：a）。叶绿体沿细胞质膜内侧分布，基粒片层和基质片层清晰可辨，由于是春季刚萌发的新叶，可以看到叶绿体的缢缩增殖现象（图1：c箭头所示），观察视野中单个细胞叶绿体的数量为2～10个不等。叶绿体缢缩增殖的生理意义在于增加了叶绿体的数量，为更多光合产物的形成提供基础保证。部分叶绿体中含有少许淀粉粒（图1：a，c）。线粒体呈圆球形毗邻于叶绿体。部分细胞的中央大液泡尚未形成（图1：a），这表明细胞还未发育成熟;而部分细胞则已经发育成熟，液泡把细胞器挤向细胞的边缘（图1：c）。有少许电子密度较低的草酸钙晶体零星随机散布于液泡中，这些晶体从观察视野来看为针晶、方晶或柱状晶等（图1：b，d分别为图1：a，c的细部特写照片）。

2.2 夏季香樟叶肉含晶细胞的超微结构

夏季香樟含晶细胞的超微结构所切部位是海绵组织，细胞质均匀（图2：a）。细胞核为圆球形，由于中央大液泡的挤压，故分布于细胞的边缘，核质均匀，核仁明显（图2：a，b）。叶绿体呈“铁饼”状分布于细胞质膜内侧，电子密度较高，为黑色;叶绿体上有电子密度较低的白色淀粉颗粒及黑色的油滴（图2：b，c）;观察视野中单个细胞中叶绿体的数量为1～12个。线粒体紧邻叶绿体沿细胞壁的内侧分布，呈长椭圆形（图2：b）和球形（图2：d），内嵴明显。中央大液泡已经形成，表明细胞已经发育成熟，占据细胞空间较大。液泡中明显可见许多电子密度较低的白色草酸钙晶体结构，这些晶体结构数量多、形态不一、大小不等，且随机散布于液泡中，从观察结果来看多为柱状晶、方晶、针晶、簇晶。这些叶肉细胞的晶体数量远比春季叶肉细胞中晶体数量要多，形态要丰富。

2.3 秋季香樟叶肉含晶细胞的超微结构

从图3可看出，所切部位为叶肉海绵组织（图3：a，c，d）和栅栏组织（图3：b）。秋季香樟叶肉的细胞壁结构完整，层次清晰（图3：a，b）。叶绿体基本沿着细胞壁的内侧分布于细胞的边缘，其结构完整，基粒片层和基质片层清晰。部分叶绿体有肿胀甚至破损的现象，这可能是由于早秋的低温所致。部分叶绿体与细胞壁之间有类似“垫衬物”存在（这些“垫衬物”有什么生理意义还不甚明了，有待进一步研究），并且电子密度较低（图3：a），这种现象在春季和夏季叶肉细胞中均没有发现。叶绿体上有大量的球形油滴和电子密度较高的黑色嗜锇体（图3：a，b，c）。线粒体圆球状数量较多，集中分布于叶绿体的附近（图3：b，d）。这些随机散布于中央大液泡中电子密度较低的白色草酸钙晶体尽管数量较夏季有了一定的减少，但比春季的晶体数量要多。从图3还可看出，这些晶体多数成团聚集在一起，有部分随机分布于液泡中。液泡中的细胞质较浓，有大量溶酶体分布（图3：b，d）。

2.4 冬季香樟叶肉含晶细胞的超微结构

如图4所示，所切部位是导管（图4：a，b）、栅栏组织（图4：c）和海绵组织（图4：d）细胞，冬季香樟叶肉细胞结构完整。导管细胞细胞壁的层次清晰，可见胞间层、初生壁、次生壁（图4：a，b）。由于次生壁的增厚不均匀，因此形成了纹孔（图4：b），在细胞壁上还有胞间连丝（图4：b）。部分叶绿体肿胀呈半球形，甚至有部分叶绿体崩溃解体（图4：c）。之所以导管中的叶绿体数量较少，而海绵组织和栅栏组织的数量较多，这可能是由于导管细胞是一种逐步成熟趋死的细胞，在成熟的导管形成之前，导管内的部分细胞器逐渐减少直至消失的缘故。电子密度较高的黑色嗜锇体和球形油滴大量聚集在叶绿体上（图4：a-d）。圆球形的线粒体聚集在叶绿体的附近（图4：b-d），其生理意义在于冬季低温时，由于产能部位的线粒体和需能部位的叶绿体之间近，因此缩短了能量运输的距离，减少了能量的损耗和运输时间，从而有利于抵御外界的低温。导管细胞中线粒体的数量较少，而栅栏组织和海绵组织的线粒体数量较多，呈聚集状。导管细胞中细胞质较浓，液泡电子密度较高，呈浅黑色。中央液泡中随机分布有电子密度较低的白色草酸钙晶体，其形状多样，大小不等，多为针晶、方晶、柱状晶。

3 讨论与结论

本研究结果发现，一年四季香樟叶肉细胞液泡中均有草酸钙晶体结构，这些晶体多为柱状晶、方晶、针晶、晶簇。就春季而言，此时期的草酸钙晶体只存在于少数细胞中，数量较少，晶体结构多为柱状晶、方晶。观察视野中只有少数细胞有草酸钙晶体结构，推测这可能是春季正处在香樟叶片发育时期，叶绿体尚未发育成熟，部分叶绿体正在通过缢缩增殖;众多小液泡的彼此融合逐渐形成中央大液泡，而草酸钙晶体结构的形成尚需要一个过程。春季叶绿体的缢缩增殖增加了叶绿体的数量，为积累更多的光合产物提供了基础保障。从夏季香樟叶肉细胞草酸钙晶体结构和春季比较来看，夏季时叶肉细胞晶体明显比春季的数量要多、体积要大、形态要丰富。这可能是夏季香樟叶片发育阶段完成（为功能叶），草酸钙晶体在液泡内的形成也已完成。秋季香樟叶肉细胞草酸钙晶体结构多为柱状晶、方晶、针晶和晶簇，和夏季的类似，比春季的数量多、体积大，多团聚在一起;秋季香樟叶肉细胞在细胞壁和叶绿体之间有1～4层大小不等的“垫衬物”存在，这些“垫衬物”电子密度较小，呈白色，在其他季节中并未发现。“垫衬物”出现在秋季有什么样的生理意义，目前还不清楚，推测是秋季气温逐步降低，细胞壁内侧出现的这些“垫衬物”对抵御外界的低温胁迫，以及保护细胞内部细胞器多了一层保护“装置”。冬季时香樟叶肉含晶细胞中细胞质较浓;部分叶绿体有肿胀崩溃现象，叶绿体上富集了电子密度较高呈黑色的油滴和嗜锇体;线粒体毗邻叶绿体呈球形，数量较多，且形态变化不明显;晶体形态为柱状晶、方晶、针晶，数量比夏季和秋季略有减少。晶体数量的减少可能是冬季低温条件下，与草酸钙晶体的分解有一定关联。草酸钙晶體分解的生理意义在于提高了香樟叶肉细胞的渗透势，这对于降低细胞内溶液的冰点有益，进而有利于香樟叶片抵御外界的低温伤害。草酸钙晶体不仅对香樟抵御低温有益，而且还可能会提高堇菜（Viola verecumda）忍耐干旱胁迫的能力（苏志孟等，2019）。徐静静等（2012）对天津盐渍化生境54种植物钙晶体的研究表明草酸钙晶体在落叶乔木、灌木抵御盐分胁迫中发挥着重要作用。越来越多的文献表明，草酸钙在缓解植物逆境胁迫方面的确有一定的作用。

香樟在遭受外界人工低温胁迫时，随着胁迫温度的逐步降低，草酸钙晶体的数量会逐步减少，体积也随之变小，晶体类型也由柱状晶、方晶转变成针晶（尤扬等，2018a）。而本研究结果发现，在观察视野内，在一年四季中均有草酸钙晶体随机分布于香樟叶肉细胞的液泡中，并且冬季草酸钙晶体的体积与夏季、秋季相比，并未减少许多，以方晶、柱状晶为主，伴以少量针晶。这可能是由于人工低温胁迫和自然降温的冬季低温胁迫有一定的差异而造成。

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（責任编辑 蒋巧媛）