纤维连接蛋白（FN）基因多态性及蛋白表达与草酸钙肾结石相关性研究

李健 章璟 洪天宇 胡传义 姜宁 张鹤

摘要：目的：探讨纤维连接蛋白（FN）基因多态性及蛋白表达与草酸钙肾结石的关系，为治疗和预防结石的复发提供一个理想的靶点。方法：通过经皮肾通道，运用腔内肾乳头活检技术，对草酸钙肾结石组及健康对照组的肾组织进行FN蛋白的检测。用聚合酶链式反应（PCR）扩增FN基因rs10202709 位点及rs35343655位点的基因型，探讨其基因型与草酸钙肾结石的关系。结果：FN蛋白在肾结石组的表达明显高于对照组。FN中C/T型表达与草酸钙肾结石的发病率正相关（P < 0.05）。结论：FN蛋白表达的差异与草酸钙结石的形成具有相关性。FN基因多态性与草酸钙肾结石的风险具有相关性，FN的C/T型可作为危险因素的标准。

关键词：纤维连接蛋白;基因型多态性;草酸钙;肾结石

【中图分类号】R-3    【文献标识码】A    【文章编号】2107-2306（2019）06-009-02

Correlation between protein expression of fibronectin gene （FN） and calcium oxalate kidney stones

Li Jian， Zhang Jing， Hong Tian Yu， Hu Chuan Yi，Jiang ning，zhang he

Department of urology， Gongli Hospital， Naval Military Medical University， Shanghai 200135

Abstract objective：Tto investigate the relationship between the expression of fibronectin gene （FN） protein and calcium oxalate kidney stones， and to provide an ideal target for the treatment and prevention of stone recurrence. Methods： The FN protein in renal tissue of calcium oxalate nephrolithiasis group and healthy control group was detected by percutaneous renal access and intraluminal renal papillary biopsy. The genotypes of FN gene rs10202709 and rs35343655 were amplified by PCR， and the relationship between the genotypes and calcium oxalate nephrolithiasis was discussed. Results： The expression of FN protein in the kidney stone group was significantly higher than that in the control group. The expression of C / T type in FN was positively correlated with the incidence of calcium oxalate nephrolithiasis （P < 0.05）. Conclusion： The difference of FN protein expression is related to the formation of calcium oxalate stone. The polymorphism of FN gene is related to the risk of calcium oxalate nephrolithiasis. The C / T type of FN can be used as the standard of risk factors.

[key words] fibronectin; Genotype polymorphism; Calcium oxalate; Kidney stones

基因與尿路结石形成的相关性已成为研究的热点，然而具体的相关机制尚不明确。草酸钙结石形成的过程中会刺激细胞产生骨桥蛋白、降钙素受体、纤维连接蛋白（FN）等一系列抑制因子，但是FN与草酸钙结石的关系并不明确。FN 第2内含子基因位点及第 26 内含子基因位点存在着等位基因多态性，其可能对FN的表达水平等产生一定的差异，从而导致抑石的效能发生改变。本研究通过对患者全血行FN基因型检测，以及运用腔内肾乳头活检技术，对Randall钙斑周围的肾组织进行FN蛋白的检测，以期找出与草酸钙结石相关的分子生物学基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年8月—2019年8月在本院接受经皮肾镜技术（ PCNL） 及开放手术治疗的30例草酸钙肾结石患者作为病例组。另选取其他非肾结石原因（ 肾脏外伤性破裂、肾脏肿瘤、无功能积水肾） 接受肾脏切除的30例患者作为对照组。对所有患者肾脏进行肾乳头活检。所有入选者均知情同意，且本研究通过医院伦理委员会的批准。

1.2方法

FN蛋白的检测：新鲜标本用液氮冰冻后，-80℃保存，采用兔抗人 FN 多克隆抗体和 SP 试剂盒，免疫组化染色采用链霉菌抗生物素蛋白 - 过氧化酶连接法进行检测，每例均以PBS 液代替一抗作为阴性对照，以正常肾皮质组织作为阳性对照。光镜下（400倍）随即观察3个高倍视野，根据着色强度的多少进行评分，阴性（-），弱阳性（+），中等阳性（2+），强阳性（3+）。

FN基因型检测：1、FN基因rs35343655位点的引物序列为上游5'-TACACTTACAGGATAGAAACACAGA-3';下 游 5'- CTCGGGATGATGGCGGAT-3'。FN基因rs10202709位点的引物序列为上游5'-TATGGCCTTTTCCTAAGAGCCTGA-3';下游5'- GGGCAAACCTCAAAGTTCGGA-3'，由上海生工生物公司合成。2、DNA提取：采集外周静脉血4ml，采用睿玻生物生产的基因组提取试剂盒提取。3、PCR扩增目的基因片段：FN基因rs35343655位点的多态性反应体系总体积20ml，PCR扩增条件为：94°C预变性2min，98°C变性30s，55°C退火30s，68°C延伸30s，40个循环;68°C再延伸5min。4、测序：PCR产物经10g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定，用ABI 3730 XL测序仪测序分析。


1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0 软件进行统计分析，两组间两两比较采用非参数Mann-Whitney U秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基本情况

草酸钙结石患者30例，其中男18例，女12例，年龄22～70岁，平均年龄49.6。对照组患者30例，其中男17例，女13例，年龄20～73岁，平均年龄43.8。草酸鈣结石组与对照组的年龄、性别构成比、体质量、身高等差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.2草酸钙肾结石患者和对照组的 FN 基因型基因频率分布见表1。

FN基因rs35343655位点携带有杂合型（）C/T的人群结石发病率风险明显高于携带野生型（C/C）和突变型（T/T）的人群（P<0.05）。

2.3 两组患者肾乳头周围组织FN蛋白免疫组化结果图 见图1。

3 讨论

肾结石是一种世界范围的常见病、多发病，其发生与生活习惯、自然环境、遗传等因素密切相关，且有明显的地区差异和种族差异，因此研究肾结石形成的相关基因或蛋白的表达与尿石的关系已成为研究尿石症遗传因素的重要内容。目前结石形成主要有三种学说：炎症反应、Ca2+代谢、成石抑制物异常。

草酸钙是肾结石的主要无机成分，草酸钙及含草酸钙的泌尿系结石约占85%，可导致肾细胞损伤，从而促进草酸钙晶体与肾表面的黏附，可刺激肾表皮细胞产生纤维连接蛋白（FN）、骨桥蛋白、和酸性黏多糖等大分子蛋白物质，在晶体的成核、生长、聚集过程中起到重要作用。研究显示草酸钙结石可能是由于基因变异与其他因素综合作用而形成的最常见的结石。FN是一种单基因编码组成的多功能糖蛋白，分子量230 KD，其基因定位于人类染色体2q34 ～36，Patel 证明约有50 个外显子。研究表明FN可以起到抑制结石形成的作用，主要由成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞合成和分泌，也可由血浆FN转化而来。当肾小管上皮受损时晶体易在其表面成核和生长，可能是草酸钙结石最初成核部位。体外研究表明，FN可以结合到草酸钙晶体表面，通过抑制草酸钙晶体的内吞和草酸钙晶体对肾小管上皮细胞的黏附作用，从而抑制草酸钙结石的形成，因此被认为是尿液中草酸钙结石的主要抑制因子之一。国外学者也曾发现在不活动的复发性结石患者中，草酸钙结晶可以刺激肾小管过度分泌FN，且作用强度与FN的量有关。在草酸钙晶体的刺激下肾小管上皮细胞的不同基因可能变异，这些基因的变异可能导致蛋白质的表达发生改变。

本研究通过采用经皮肾腔内活检技术，对草酸钙患者及非结石患者肾乳头周围肾组织进行活检，运用免疫组化（S-P）技术，观察FN蛋白的表达情况，研究显示，结石组肾组织中FN的表达较对照组明显增高，说明草酸钙晶体有可能刺激FN的表达。虽然FN 具有抑制结石形成的作用，但晶体形成过多时，FN可能失去了抑制草酸钙晶体的作用。

有研究表明，FN 第2内含子基因位点及第 26 内含子基因位点存在着等位基因多态性，这种多态性可能对FN的表达及肾结石的形成有一定的相关性。本研究发现FN基因rs35343655位点携带有杂合型（C/T）的人群结石发病率风险明显高于携带野生型（C/C）和突变型（T/T）的人群，而两组患者rs10202709位点均为发生突变。我们分析草酸钙结石的形成与rs35343655位点的杂合突变具有相关性。

综上所述，对FN基因的深入研究也许可以找到与草酸钙肾结石相关的分子機制，为筛选治疗的靶点基因提供依据。

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基金项目：浦东新区公利医院青年英才人才培养计划（GLRq2019-01）;浦东新区卫计委青年科技项目（PW2016B-10）。