含ZnO多孔生物玻璃骨修复支架的制备及体外性能研究*

王 薇 苏 欣 王 珍 王建春 王宏远

目前，国民生活水平普遍提升，口腔种植技术飞速发展，人们已将种植义齿当作牙齿缺失的首选修复方法，然而骨缺损却严重限制了种植义齿的临床应用。自体骨移植来源有限、移植过程会增加患者创伤且有时会诱导供区处健康组织的坏死；异体骨移植有传播疾病的风险，且需进行免疫抑制药物管理；因此，兼具生物活性和安全性的骨替代材料越来越受到广大研究人员的关注［1］。生物玻璃（BG）具有良好的生物活性、生物相容性、能促进骨和软组织的再生，并且，向BG中加入功能性金属元素还可以提高其生物学功能［2-4］。ZnO能够促进成骨细胞黏附、增殖，有助于骨组织的生长，并有一定的杀菌消毒功能［5］。相关研究表明，传统铝硅酸盐玻璃中的铝元素在骨修复移植领域中应用时呈现出一定的神经毒素特征，因此需要制备不含有氧化铝或尽量减少氧化铝含量的BG［6］。然而国内外关于ZnO全部或部分取代Al2O3对BG机械性能、生物活性及生物降解等方面的影响却鲜有报道。本实验以铝硅酸盐玻璃为基础，用ZnO取代部分Al2O3，采用有机泡沫浸渍法，制备出一种含锌多孔BG骨修复支架材料，并对其机械、生物性能进行测定及分析如下。

1.材料与方法

1.1 实验材料及设备

实验材料见表1

实验设备见表2

表2 实验设备

1.2 研究方法 本实验主要研究不同含量ZnO取代Al2O3对多孔生物玻璃（BG）支架的孔隙率、抗压强度（CS）、抗弯强度（BS）、降解性能及体外矿化活性的影响。

以铝硅酸盐玻璃（Al2O3-SiO2-CaO-P2O5-Na2O）为基础，用不同含量（1、2、3wt%）的ZnO（六角晶系结晶体）取代铝硅酸盐玻璃中的Al2O3(见表3)，采用熔融法制备含ZnO 的基础玻璃（Al2O3-SiO2-CaO-P2O5-Na2O-ZnO）。然后以聚氨酯海绵为模板（在300℃左右时会挥发而不留杂质），采用有机泡沫浸渍法，制备出含ZnO的多孔BG支架，分别为A组：不含ZnO的BG支架，B组：含1wt%ZnO的BG支架，C组：含2wt%ZnO的BG支架，D组：含3wt%ZnO的BG支架。

表3 含ZnO多孔BG支架质量百分比（wt%）

1.3 实验过程

1.3.1 基础玻璃的制备 基础玻璃用熔融法制备：将原料研磨均匀后，放入高温箱式电阻炉中烧结（1500℃、保温2h)，水淬、烘干，制得基础玻璃（见图1）。

图1 基础玻璃试样

1.3.2 多孔生物玻璃（BG）支架煅烧温度的确定多孔BG支架的煅烧温度应该在基础玻璃的软化温度与析晶温度之间，基础玻璃的软化温度通过热膨胀测试获得，析晶温度通过差热分析获得，升温速率均为5℃/min，测试范围从室温到1200℃（见表4）。

表4 基础玻璃温度参数

1.3.3 多孔生物玻璃（BG）支架的制备 多孔BG 支架用有机泡沫浸渍法制备［7］。①将基础玻璃破碎、研磨、过200 目筛和325 目筛，得到粒径在0.045-0.074mm 之间的玻璃粉末。②聚氨酯海绵改性：用15wt%的NaOH溶液，在60℃的水浴锅中，对40ppi（ppi：指每平方英寸的海绵质）的聚氨酯海绵进行改性处理，改性时间为40min（改性后的聚氨酯海绵更加蓬松、柔软，更有利于挂浆），取出后用清水冲洗，室温下晾干。③将改性后的聚氨酯海绵完全浸入配好的浆料（56wt%的基础玻璃粉，1.8wt%的乙基纤维素—粘结剂，15wt%的聚乙二醇5ml—分散剂，20ml 的无水乙醇—溶剂）中，再挤出多余浆料，使少量浆料均匀粘附在海绵骨架上，然后在室温下干燥24h，80℃干燥箱中干燥2h，将样品放入高温箱式电阻炉中进行烧结（经过在工作窗口温度范围内进行试烧，最终确定理想的烧结温度制度，具体见表5），然后随炉冷却，制备出理想的多孔BG支架。

表5 多孔BG支架的成型温度

1.3.4 多孔生物玻璃（BG）支架试件的制备 在本实验中，需要制备三种尺寸的试件（见图2）。分别为测试孔隙率、降解性能、体外矿化活性的5mm×5mm×5mm 的块状支架，测试抗压强度（CS）的10mm×10mm×10mm 的块状支架，测试抗弯强度（BS）的25mm×5mm×5mm 的长条形支架。实验中，去除有堵孔、支架坍塌等有缺陷的试件。

1.3.5多孔生物玻璃（BG）支架孔隙率的测定

根据阿基米德原理，多孔BG 支架的孔隙率按照公式1 进行计算，每组10个试样，最后孔隙率为10个试样孔隙率的平均值。

式中：P－孔隙率，% ma-试样干重，g

mb-饱和试样在水中的悬重，g mc-饱和试样的质量，g

图2 不同尺寸的试件

1.3.6 多孔生物玻璃（BG）支架抗压强度（CS）及抗弯强度（BS）的测定 室温干燥环境下，利用万能力学试验机测试。每组设10个平行样，CS 采用单轴压缩试验测定（测试过程中要保证上下表面与探头充分接触），所用样品为10mm×10mm×10mm 的立方体支架；BS 采用三点弯曲试验测定，所用样品为25mm×5mm×5mm 的长条形支架。测试加载速率均为0.5mm/min，最大载荷为5.0KN。最终的CS及BS为10个试样的平均值。

试样的CS按照公式2进行计算

σ＝P/S（公式2）

式中：σ－抗压强度，MPa

P－试样的破坏载荷，N

S－样品与探头的接触面积，mm2

试样的BS按照公式3进行计算。

σ=3Fl/(2bd^2)（公式3）式中：σ－抗弯强度，MPa

F－最大弯曲载荷，N l－跨距，mm

b－试样的宽，mm d－试样的高，mm

1.3.7 多孔生物玻璃（BG）支架降解性能的研究 通过测量各组多孔BG 支架在模拟体液（Simulated Body Fluid，SBF）中浸泡不同时间（1d、3d、7d）后的重量损失，来探究多孔BG 支架的降解性能。在湿度大于90%、温度为37℃的恒温箱中，将各组多孔BG 支架分别浸泡于SBF 溶液（PH=7.4）中，样品质量与SBF 溶液体积比为1.0mg/mL，SBF 浸泡液每24h 更换一次。分别在1d、3d、7d后，取出样品，用去离子水和无水乙醇冲洗，然后置于80℃的烘箱中干燥至恒重，测量样品的质量损失［8］。本实验设置1d、3d、7d三个时间节点，每个节点设5个平行样。

试样的失重比例按照公式4进行计算。

L%＝（m0-m1）/m0×100%（公式4）

式中：L%－质量损失百分比

m0－浸泡前样品干燥质量，g

m1－浸泡后样品干燥质量，g

1.3.8 多孔生物玻璃（BG）支架体外矿化活性的研究 首先，在无水乙醇中超声荡洗多孔BG 支架5min，置于空气中自然干燥。然后，将各组多孔BG支架分别浸泡于装有SBF溶液（PH=7.4）的聚乙烯瓶中（支架重量与SBF的比例为1.0mg/mL），置于湿度大于90%，温度为37℃恒温箱中，不更换SBF浸泡液，分别在1d、3d、7d后，取出支架，用去离子水和无水乙醇冲洗，然后在空气中自然干燥。随后利用扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）观察各组多孔BG支架浸泡后的形貌与微观结构的变化（测试前需在试件表面喷金，以增强多孔BG支架的导电性），各组材料分别随机选取5个不同位置拍照；将多孔BG支架砸碎，用三头研磨机研磨成粉末状后利用X线衍射分析（X-ray Diffraction，XRD）样品浸泡后的物相组成［8］。

1.4 统计学方法 使用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料用（±s）表示，多组数据结果比较用单因素方差分析，进一步两两比较用最小显著性差异法（Least-significant difference，LSD）检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 ZnO 含量对多孔生物玻璃（BG）支架孔隙率的影响 采用单因素方差分析，A、B、C、D 四组多孔BG 支架的孔隙率无统计学差异（P=0.343＞0.05）。说明随ZnO 含量的增加，多孔BG 支架的孔隙率无差异（见表6）。

表6 含不同含量ZnO多孔BG支架的孔隙率（%）比较（-x±s）

2.2 ZnO 含量对多孔生物玻璃（BG）支架抗压强度（CS）的影响 采用单因素方差分析，A、B、C、D四组多孔BG 支架的CS 有统计学差异（P=0.000＜0.05），进一步两两比较，有统计学差异（P＜0.05），说明随ZnO 含量的增加，多孔BG 支架的CS 逐渐下降（见表7）。

表7 含不同含量ZnO多孔BG支架的抗压强度（MPa）比较（-x±s）

2.3 ZnO 含量对多孔生物玻璃（BG）支架抗弯强度（BS）的影响 采用单因素方差分析，A、B、C、D四组多孔BG 支架的BS 有统计学差异（P=0.000＜0.05），进一步两两比较，有统计学差异（P＜0.05），说明随ZnO 含量的增加，多孔BG 支架的BS 逐渐下降（见表8）。

表8 含不同含量ZnO多孔BG支架的抗弯强度（MPa）比较（-x±s）

2.4 ZnO 含量对多孔生物玻璃（BG）支架降解性能的影响 采用单因素方差分析，A、B、C、D 四组多孔BG 支架在SBF 中浸泡7d 的失重比例有统计学差异（P=0.000＜0.05），进一步两两比较，A 组与B 组比无统计学差异（P=0.164＞0.05），其余各组两两之间均有统计学差异（P＜0.05）。说明在SBF中浸泡7d 后，随ZnO 含量的增加，多孔BG 支架的降解性能逐渐增强（见表9，见图3）。

表9 含不同含量ZnO的多孔BG支架在SBF中浸泡7d的失重比例（%）比较（-x±s）

图3 含不同含量ZnO的多孔BG支架在SBF中的失重曲线

2.5 ZnO含量对多孔生物玻璃（BG）支架羟基磷灰石（HA）沉积的影响 图4为含ZnO多孔BG支架在SBF中浸泡不同时间后的SEM照片。从图中可以看出，在SBF中浸泡7d后，A组（图4a）表面只沉积了少量颗粒，没有形成HA薄膜。浸泡7d后，B组（图4b）表面见颗粒沉积，与A组相比，尺寸稍大一些，也未见HA薄膜形成。浸泡3d（图4c）后，C组表面即见颗粒沉积，7d（图4d）后，表面形成HA薄膜。浸泡1天（图4e）后，D组表面即见大量颗粒沉积，3d（图4f）后，表面形成典型的HA薄膜。

图4 含ZnO多孔BG支架在SBF中浸泡后的SEM照片（a）A组，7d；（b）B组，7d；（c）C组，3d；

（d）C组，7d；（e）D组，1d；（f）D组，3d.

对浸泡后样品的XRD 分析证实了SEM 的观察结果。浸泡7d 后，A 组（图5a）、B 组（图5b）多孔BG 支架XRD 图谱与浸泡前相似，均为馒头峰，表明多孔BG 支架仍为无定形态结构，表面沉积的颗粒并未形成结晶态的HA。浸泡前C 组（图5c）多孔BG 支架的XRD 图谱为馒头峰，浸泡3d 后，仍为弥散性较强的漫散射峰，浸泡7d后，XRD图谱上出现了衍射峰，经对照，分别为HA（002）晶面和（211）晶面的特征衍射峰，表明表面的沉积物已转化为晶态HA。浸泡前D 组（图5d）多孔BG 支架的XRD图谱为馒头峰，浸泡1d 后，仍为弥散性较强的漫散射峰，浸泡3d 后，XRD 图谱上出现了衍射峰，经对照，分别为HA（002）晶面和（211）晶面的特征衍射峰，表明表面的沉积物已转化为晶态HA。说明随ZnO 含量的增加，多孔BG 支架体外矿化活性逐渐增强。

3.讨论

3.1 Al2O3对生物玻璃（BG）性能的影响 郭宏伟等［9］通过研究Al2O3含量对无碱铝硼硅玻璃网络结构的影响得出，Al2O3作为网络中间体，通过与硅氧四面体［SiO4］相连，将断裂的Si-O 网络连接起来，使结构网络增加，使更多的网络修饰体可以进入玻璃网络，使玻璃网络结构变得紧密。因此，在一定范围内，随Al2O3含量的不断增加，玻璃的网络结构变得更加完整，使得玻璃的强度不断增强。但是，有研究表明，玻璃的生物活性会因为其网络结构的增强而下降，甚至变为生物惰性。Andersson等［10］认为，铝离子溶解后会与周围组织相结合，从而占据玻璃与组织的结合位点；铝离子会占据Ca2+、PO43-与富硅层的结合位点，从而降低玻璃表面富硅层的交联度；铝离子还会与富钙、磷层结合，形成与骨中的HA 不相容的复合物，这就解释了为什么Al2O3的引入会使玻璃的生物活性下降。

3.2 ZnO 对生物玻璃（BG）性能的影响 本研究发现，随着氧化锌含量增加, BG 支架的抗压强度（CS）和抗弯强度（BS）均下降，而郭炜煌［8］将2wt%的四角状氧化锌加入到BG/明胶复合支架中，却显著增强了复合支架的CS 和BS，这种结果差异是由四角状氧化锌和普通氧化锌的结构差异导致的，与普通氧化锌相比，四角状氧化锌具有独特的四针状结构，依靠此结构可以使其紧密包裹于BG 支架中，从而增强BG 支架的网络结构，进而增强BG 的机械强度［11］。因此，后续实验可将不同尺寸形态的氧化锌加入到BG 中，研究不同尺寸形态的氧化锌对BG性能的影响。

图5 含ZnO多孔BG支架在SBF中浸泡后的XRD 图谱

Shepherd DV 等［12］研 究 发 现，锌 可 以 激 活Runx2基因表达，抑制骨髓间充质细胞向破骨细胞样细胞转化，还可以启动成熟破骨细胞凋亡来抑制破骨细胞骨吸收进程。Zhao 等［13］采用传统熔炼铸造技术，制备出含锌硼酸盐BG 支架，该BG 支架与人骨小梁有着类似微结构，对该含锌硼酸盐BG 支架进行体外细胞培养，结果表明，含锌BG可以促进碱性磷酸酶的分泌表达，进而促进人间充质干细胞的增殖和分化。对鼠颅骨缺损修复实验进一步证实，含锌BG 组骨再生能力显著高于不含锌BG 组。本课题组后续将对制备的多孔BG 支架进行体外细胞培养及动物体内实验，进一步研究ZnO 取代Al2O3对多孔BG 支架生物相容性、成骨细胞增殖能力及体内降解性能的影响，找到ZnO 取代Al2O3的最适宜量，使机械强度、生物活性及生物相容性有效结合，使多孔BG 支架材料的降解速度与成骨速度相匹配，从而为开展新型高强度BG 骨修复支架材料的研究和相关产品开发提供一定的理论支持。

3.3 实验结果讨论 影响生物玻璃（BG）性能的决定因素是玻璃的Si-O 网络结构［14］，而锌离子正是通过调节BG 的Si-O 网络来影响其性能。ZnO 取代Al2O3会使玻璃网络中出现更多的断点，使玻璃网络的完整性下降，进而促进玻璃的离子释放和降解，促进羟基磷灰石（HA）的形成，因此，本实验中，随着ZnO 取代Al2O3含量的增加，多孔BG支架的降解性能及体外矿化活性逐渐增强。这与杜瑞琳［14］用ZnO 取代58S 玻璃中的CaO 得出，随ZnO 含量的增加，58S 玻璃的降解速度和HA 沉积下降，结论不一致。分析原因为，ZnO、Al2O3、CaO对玻璃Si-O 网络结构的影响不同，ZnO 取代Al2O3，使玻璃网络的完整性下降，故而促进玻璃的降解和HA 沉积；而ZnO 取代CaO，使玻璃的网络结构更紧密，从而限制玻璃的降解和HA 沉积，因此会出现不一致的研究结果。

A 组与B 组BG 分别含有3wt%和2wt%的Al2O3，A、B两组BG在SBF中浸泡7d后均未见HA形成，故A、B 两组BG 无体外矿化活性，即玻璃中含有少量的Al2O3就会使玻璃丧失生物活性。这与Hench［15］研究发现，当45S5 玻璃中Al2O3含量达到3wt%时，BG即失去生物活性，结果一致。

A、B、C、D 四组多孔BG 支架都具有较高的孔隙率（超过50%），各组之间没有明显的差异，并且均在人体松质骨的孔隙率范围内，符合人工骨材料的要求。分析其原因为，本实验采用有机泡沫浸渍法制备多孔BG支架，浆料主要粘附在海绵骨架上，在烧结过程中，海绵挥发而不留下多余杂质，故获得的多孔BG 支架具有与泡沫海绵类似的结构，因此，多孔BG 支架的孔隙率主要受聚氨酯海绵尺寸的影响［16］。另外，在用有机泡沫浸渍法制备多孔BG 时，挂浆料的方法也会对多孔玻璃的孔隙率产生影响。若没有让有机泡沫充分吸收料浆，挂浆料少，烧成时容易使多孔玻璃支架坍塌，不能得到完整的支架；若挂浆料过多，则容易引起堵孔的现象，从而影响孔隙率的大小。因此，为了防止堵孔或玻璃支架坍塌，保证料浆能够在有机泡沫上均匀分布，常采用手工挤压、离心法、吸附法等来进行浆料浸渍［7,17］。

随着ZnO 取代Al2O3含量的增加，多孔BG 支架的抗压强度（CS）及抗弯强度（BS）不断下降，D组多孔BG 支架仅能达到人体松质骨CS及BS的下限，仍不能用于承载骨方面的修复。这与Oki 等［18］的研究发现，随ZnO含量的上升，BG支架材料的强度会下降，结果一致。分析原因，这与Al2O3含量的下降也有关，Al2O3含量下降，会使玻璃网络的完整性下降，从而使玻璃的强度下降［9］。

仅本研究结果而言，ZnO 取代Al2O3对多孔BG支架的孔隙率影响较小，孔隙率主要受聚氨酯海绵尺寸的影响。ZnO 取代Al2O3会降低多孔BG 支架的抗压强度及抗弯强度，当ZnO 完全取代Al2O3时，BG 支架仅能达到人体松质骨的最低机械强度要求，因此，需要进一步调整BG 的化学组分来提高其机械强度。ZnO 取代Al2O3能增强多孔BG 支架的降解性能及体外矿化活性，为后续进行细胞体外培养及动物体内实验提供了实验基础，为开展新型生物玻璃骨修复支架材料的研究和相关产品开发提供一定的理论支持。