TGF-β对衰老小鼠肠道功能作用的初步研究*

呼 峰 李珊珊 周伟伟 胡 磊 夏登胜

随着人口老龄化的到来，我国已开始步入老龄化社会。人随着年龄的增长，机体的生理功能开始逐渐下降，口腔各组织结构也会出现相应的增龄性变化［1］，如牙体牙周、黏膜、牙龈、颌骨、肌肉、皮肤、关节等的衰老［2］，这些组织的衰老不仅可直接导致老年口腔疾病, 如龋病、牙周病、黏膜病等，影响老年人进食，进而对全身健康造成不利影响，还可直接影响到老年人口腔疾病的诊断与治疗。

胃肠是机体摄取营养的主要场所，每天必须消化、吸收人体中的食物，以提供体内器官与细胞足够的养分。一旦肠道开始老化，全身其他组织器官也将随之衰老。肠道衰老可导致组织结构和功能性黏膜防御缺陷、组织氧化应激增加、保护性免疫能力下降、炎症［3-5］，严重影响了老年人群的生活质量和身体健康，同时还可直接或间接引起和加重某些器质性疾病如消化道肿瘤、心脑血管意外和心理疾患等的发生、发展。因此，预防肠道衰老对全身系统及口腔健康均有重要作用。

Franceschi等［6］于2000年提出炎性衰老的概念，认为衰老是一种慢性、无菌、低度的炎症。Salvioli等［7］发现促炎症细胞因子在衰老中起到独特作用。有报道称，老人体内促炎因子的水平是年轻人的2～4倍［8］。慢性炎症升高组织内ROS水平，而ROS可导致DNA错误复制、环境刺激致基因损伤［9］。此外，组织损伤促进细胞分泌更多促炎因子［肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素（interleukin，IL）等］加重炎症［10］。研究发现，肠道黏膜内炎症和抗炎细胞因子之间的平衡与肠道衰老密切有关，已发现部分与肠道衰老相关的促炎细胞因子，如IL-1b、IL-6和TNF-α［11-13］。转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）是一种具有多种功能的蛋白多肽，它广泛存在于动物各种正常组织细胞以及各种转化细胞中，可以调控细胞的迁移、粘附，刺激胞外基质的合成，对多种类型细胞的增殖分化起促进作用［14，15］。研究证实，TGF-β家族在衰老方面发挥着至关重要的作用［16］。但炎症细胞因子在肠道衰老中的具体作用仍不清楚。本实验将通过观察小鼠生理衰老过程中组织学及炎症因子表达的增龄性变化，初步研究炎性细胞因子对小鼠肠道衰老的作用。

1.材料和方法

1.1 实验材料2、6、18月龄SPF级C57雄性小鼠（北京维通利华提供）；TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17 和INF-γELISA 试剂盒（达科为，中国）；CBA试剂盒（BD，美国）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂（Sigma，美国）；TGF-β1抗体（Abcam，美国）；抗兔IgG-HRP(Santa Cruz，美国)；DAB 显色试剂盒（CST，美国）；10%水合氯醛（国药，中国）。本实验操作符合首都医科大学附属北京口腔医院动物实验伦理操作要求。

1.2 实验仪器 倒置荧光显微镜（Nikon，日本）；流式细胞仪（BD，美国）；高速离心机（Thermo Fisher，美国）。

1.3 小鼠小肠上皮组织学观察2、6、18月龄雄性C57小鼠各10只，饲养1周，观察各小鼠饲养期间粪便性状［17,18］；1周后10%水合氯醛（剂量0.2ml/kg）腹腔注射麻醉后脱颈处死，取小鼠胃部以下10mm 处小肠，经多聚甲醛4℃固定过夜后脱水、浸蜡、石蜡包埋。按5μm连续切片。切片经二甲苯15min，100%无水乙醇3min，90%酒精3min，75%酒精3min，梯度酒精脱蜡至水。苏木素染5min后，水洗，PBS 浸泡5min，伊红染色2min，水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，倒置显微镜下观察拍照。

1.4 血清中炎症相关细胞因子检测 选取年轻小鼠（2月龄）和衰老小鼠（18月龄）各10只，10%水合氯醛（0.2ml/kg）腹腔注射麻醉后脱颈处死，取小鼠小肠，加入RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆裂解30min 后，上离心机离心，收集上清液。上清液于-80℃下保存备用。采用CBA法流式检测上清液中细胞因子含量，经相应ELISA试剂盒进行验证。

免疫组化：小鼠组织切片经脱蜡浸水后，经柠檬酸钠缓冲液抗原修复10min。经封闭1h，加入TGF-β1抗体孵化过夜。再加入抗兔IgG-HRP，用DAB显色试剂盒显色，倒置显微镜下观察拍照，Image J进行分析。

1.5 TGF-β 对衰老小鼠小肠上皮的作用 选取衰老小鼠（18月龄）的小鼠20 只，随机分为两组，每组10 只。TGF-β 组：小鼠腹腔注射TGF-β（100ng/kg），每周注射1次，注射4次。对照组：小鼠腹腔注射生理盐水（100ng/kg），每周注射1次，注射4次。两组小鼠常规饲养1个月后，10%水合氯醛（剂量0.2ml/kg）腹腔注射麻醉后脱颈处死，取小鼠胃部以下10mm 处小肠，切片、HE 染色后，倒置显微镜下观察拍照。

1.6 统计学分析 使用SPSS 21.0 进行数据分析，粪便性状指数比较采用卡方检验，细胞因子水平比较采用t 检验，柱状图采用Graphpad 6.0 制作。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1 衰老小鼠小肠上皮组织学改变 小鼠随着年龄增长，小肠上皮出现萎缩，厚度明显减小。与2月龄及6月龄小鼠相比，18月龄小鼠粪便性状发生改变，粪便逐渐变软、不成型，提示衰老小鼠消化吸收功能逐步退化（图1）。

图1 小鼠小肠上皮组织增龄性改变A：小鼠小肠上皮2、6、18月龄组织学变化（标尺：100μm）；B：小鼠粪便性状改变

2.2 年轻和衰老小鼠小肠上皮中细胞因子水平变化 由图2可知，与年轻小鼠相比，衰老小鼠小肠上皮组织中TGF-β、TNF-α、IL-2、4、6、10、17和干扰素γ（INF-γ）8种细胞因子表达发生变化。衰老小鼠组织上清液中仅TGF-β表达水平出现明显下降，和年轻小鼠相比，差异有显著性（P＜0.05）；而其余细胞因子表达水平均提高，其中TNF-α、IL-4和IL-6的细胞因子水平有统计学差异（P＜0.05）；IL-2、IL-10、IL-17和INF-γ的细胞因子水平没有显著性差异（P＞0.05）。

2.3 小鼠小肠免疫组化结果 免疫组化结果显示：年轻小鼠小肠上皮层、黏膜下层、肌层和浆膜均有大量TGF-β表达，其中在管状肠腺的底部TGF-β高表达，提示TGF-β可能与小肠上皮的细胞更新密切相关。衰老小鼠小肠各区域中TGF-β表达水平明显低于年轻小鼠（P＜0.05）（图3）。

图2 年轻小鼠和衰老小鼠小肠上皮中细胞因子水平A:TGF-β；B：TNF-α；C：IL-2；D：IL-4；E：IL-6；F：IL-10；G：IL-17；G：INF-γ

图3 年轻小鼠和衰老小鼠小肠上皮A：年轻小鼠免疫组化结果（标尺：100μm）；B：衰老小鼠免疫组化结果（标尺：100μm）；C：小肠上皮中TGF-β表达水平

2.4 TGF-β对衰老小鼠小肠上皮的作用结果

利用衰老小鼠腹腔注射TGF-β，1个月后组织学发现，与对照组相比，TGF-β注射组小鼠小肠上皮萎缩明显改善，厚度明显增高。ELISA 检测发现TGF-β组衰老小鼠小肠组织中TGF-β的表达水平明显高于对照组（P＜0.05），同时TGF-β组小鼠的粪便成型，较对照组有明显改善（P＜0.05）。说明TGF-β可以促进衰老小鼠小肠上皮的吸收功能，延缓衰老进程。

图4 衰老小鼠腹腔注射TGF-β 1个月后的变化A:对照组和TGF-β组的镜下结果（标尺：200μm）；B：对照组和TGF-β组组织上清液中TGF-β的表达水平；C：对照组和TGF-β组小鼠粪便性状指数

3.讨论

衰老是生物的自然变化规律，随着年龄增长，人体器官功能逐步减退。老年人因牙周炎缺牙而导致咀嚼功能下降［19］，舌乳头减少使味觉改变，唾液腺腺泡减少和萎缩而导致口干［2，20，21］，进而影响全身健康。而且老年人普遍存在消化吸收和免疫功能减退的情况，会影响营养摄取，与小肠上皮黏膜的变化有密切联系［22］。炎症细胞因子既参与口腔黏膜的凋亡，同时也可以促进黏膜的重建和修复［23，24］，但炎症细胞因子是对于肠道衰老的机制尚不完全清楚。

本研究观察到小鼠正常生理衰老情况下小肠上皮出现萎缩，粪便性状改变，呈现出变软和不成型的形态，说明小鼠小肠随着年龄增长，小肠消化吸收功能减退，这跟小鼠小肠上皮黏膜细胞增殖能力下降，增殖减慢，杯状细胞、潘氏细胞和干细胞数目减少有关［22，25］。有学者发现，小肠上皮干细胞线粒体DNA的突变与年龄有关，这种基因突变会影响小肠上皮干细胞呼吸链的功能进而加速细胞的凋亡，进而导致肠黏膜的厚度在老化过程中逐渐下降［26］。为了证实和筛选影响小鼠肠道功能的炎症细胞因子，本研究对小鼠小肠上皮组织上清液中细胞因子进行流式细胞检测和ELISA 检测，筛选出TGF-β、TNF-α、IL-2、4、6、10、17和INF-γ8种细胞因子。本研究中衰老小鼠小肠中TGF-β比年轻小鼠明显降低，有统计学意义；其余细胞因子表达水平均较年轻小鼠提高，其中TNF-α、IL-4和IL-6的细胞因子水平有统计学差异，IL-2、IL-10、IL-17和INF-γ的细胞因子水平没有显著性差异。说明在小鼠小肠上皮增龄性变化中TGF-β、TNF-α、IL-4和IL-6可能起到了一定作用。

TGF-β是一类具有强烈刺激细胞增殖分化的生长因子，具有广泛的靶细胞，对上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞具有明显的生物学作用［27］。研究发现TGF-β是间充质干细胞重要的调节分子，影响干细胞的增殖，自我更新与多向分化［28，29］，对胚胎发育、细胞增殖、衰老、肿瘤发生等生长调控及创伤愈合起到重要作用。TGF-β可以促进口腔黏膜重建和修复，延缓口腔黏膜的细胞衰老。有研究证实，TGF-β1能促进大鼠口腔黏膜固有层前体细胞的分化，提高细胞基质分泌和矿化能力［17］。TNF-α是一种重要的促炎因子和免疫应答调节剂，在炎症反应及骨病理、生理过程中起重要的作用，并且炎症因子可以通过多种复杂信号通路调控干细胞的生物学特性［30］。白细胞介素是一类来源于单核-巨噬细胞的多功能生物活性物质，属于前炎症细胞因子，能够引发宿主免疫反应，诱导细胞凋亡［31］。INF-γ属于Th1型细胞因子，其主要用于介导免疫应答［32］。何玉廷等［33］发现，IL-4、IL-6和TNF-α均被作为炎性衰老的血清学标志物。但也有学者发现，SD大鼠血清中IL-2含量降低，18、24月龄开始差异有显著性， IL-6、IL-10含量逐渐升高，24月龄时差异有显著性， IL-4，INF-γ含量未见明显改变［34］。向婷婷等［35］发现IL-6、IL-17、TNF-α和INF-γ的表达随着大鼠年龄的增长，表达逐渐增加。上述实验说明小鼠小肠上皮增龄性改变可能存在多种细胞因子调节。本实验只选择TGF-β一种细胞因子进行初步研究。

本研究免疫组化验证，衰老小鼠小肠上皮表达的TGF-β有明显减少。衰老小鼠腹腔注射TGF-β后，小肠上皮中TGF-β含量得到明显提升，小鼠小肠上皮黏膜萎缩和粪便性状均得到改善，说明TGF-β具有延缓小鼠小肠上皮衰老的作用，可以促进小肠营养吸收。生长分化因子11（GDF11）是TGF-β家族的一员，在多种器官和组织中表达，TGF-β/Smad通路通过激活p21基因诱导细胞周期阻滞来干预哺乳动物胚胎发育期间的程序性衰老，可延缓心脏、骨骼肌、大脑、骨骼、血管等多个器官和组织的衰老进程［36］，与本实验研究结果一致。

研究机体衰老对于全身健康，特别是对老年人的生活质量有着重要意义。通过研究衰老小鼠小肠组织形态学和炎症因子水平变化，以及TGF-β对小肠上皮衰老的延缓作用，小肠营养吸收功能得到改善，对于机体稳态平衡有着积极的作用。本实验仅研究了TGF-β在衰老小鼠肠道功能退化中的影响，今后的实验中还会深入研究其他细胞因子对口腔黏膜以及肠道上皮的调节机制。