微滴式数字PCR评价保存时间和冻融对细菌基因组DNA稳定性的影响

薛盼盼，张京云

中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所，北京 102206

核酸检测技术是目前应用最广泛的微生物检测技术之一[1]，常用于疾病诊断、菌毒株分型和溯源、病原体耐药性和致病力分析等方面。保证核酸的高质量往往是获得可靠检测结果的前提。影响核酸稳定性的因素很多，例如酶促过程、氧化损伤、紫外线辐射和水解等[2]。低温冷冻保存可以延缓核酸水解和氧化作用，因此被作为长期保存标本和核酸的重要手段。反复冻融会加速核酸降解与损伤，因此标本与核酸在冻存过程中要避免反复冻融。但是，每次冻融会对核酸造成多少影响，以及不同保存温度下冻融操作的影响是否有差异，这些都缺少精确定量的数据。

微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是一种可对靶标基因绝对定量的方法，目前在肿瘤学[3]、传染病检测[4]等方面受到关注。ddPCR检测时，反应体系被分散成几万至几百万个有限体积的微滴，每个微滴包含0、1个或几个拷贝的靶标核酸；每个微滴进行独立的PCR反应后，通过计数反应阳性微滴的比例，根据泊松分布原理可计算原始模板浓度[5]。与实时荧光PCR相比，ddPCR对靶标的定量不依赖标准曲线、内参对照和扩增阈值，结果更直观；重复性好，对扩增抑制剂耐受性好，可避免对原始模板浓度评估的偏倚[6]。

我们以纯化的沙门菌和志贺菌基因组DNA为研究对象，用ddPCR方法分析了5个常用的保存温度下，反复冻融和保存天数对2种细菌的靶标基因拷贝数的影响，可为实验室选择适当的核酸保存条件、评估冻存造成的损耗等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鼠伤寒沙门菌LT2和宋氏志贺菌临床分离株SH1均在含20%甘油的冻存液中于-70℃长期保存。菌株使用时，先在普通LB琼脂平板上划线培养，于37℃孵育过夜，次日选择圆形、湿润的典型单菌落再次划线培养，取平板上的新鲜培养物进行后续试验。

扩增预混液ddPCR Supermix for Probes、微滴生成油（droplet generation oil for probes）、微滴生成卡（DG8 cartridges for QX100/QX200 droplet generator）、微滴生成卡胶垫（droplet generator DG8 gaskets）、96孔 PCR板、封板膜（pierceable foil heat seal）、QX200微滴式数字PCR系统[包括微滴生成器（QX200 droplet generator）和微滴读取仪（QX200 droplet reader）]、热封仪 PX1 PCR plate sealer（Bio-Rad公司）；EX-RNA/DNA病毒提取试剂盒（磁珠法）、NP968-C全自动核酸提取仪（西安天隆科技有限公司）；Labcycler PCR仪（SensoQuest公司）。

1.2 引物和探针

用双重ddPCR体系同时检测沙门菌和志贺菌基因组DNA，引物和探针引自文献[7]。沙门菌上游引物 SM-F（5′-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3′），下游引物 SM-R（5′-AGCAATGGAAAAAGCA GGATG-3′），探 针 SM-Probe（5′FAM-CATTTCTTA AACGGCGGTGTCTTTCCCT-3′BHQ1）；志贺菌上游引物 SH-F（5′-CGCAATACCTCCGGATTCC-3′），下游引物 SH-R（5′-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3′），探 针 SH-Probe（5′HEX-AACAGGTCGCTGCATGG CTGGAA-3′BHQ1）。引物和探针由生工生物（上海）股份有限公司合成。

1.3 细菌核酸提取

将普通LB琼脂平板上过夜培养的沙门菌LT2和志贺菌SH1新鲜菌落，以10 μL接种环挑起并悬于1.5 mL微量离心管内的1 mL PBS溶液中，振荡混匀后高速离心，去上清，用1 mL PBS洗1次，200 μL去离子水悬起，用EX-RNA/DNA病毒提取试剂盒（磁珠法）在NP968-C全自动核酸提取仪上提取细菌DNA，洗脱体积为100 μL。

1.4 ddPCR检测

1.4.1 体系配制 20 μL探针法ddPCR反应体系包括10 μL扩增预混液，沙门菌和志贺菌各条引物的终浓度均为800 nmol/L，2条探针的终浓度均为250 nmol/L，沙门菌核酸和志贺菌核酸各1 μL，用无菌去离子水补充体积至20 μL。

1.4.2 微滴生成 将配制的反应液全部转移至微滴生成卡样品孔中，每个油孔中加入70 μL微滴生成油，然后转移到微滴生成器制备微滴。

1.4.3 封PCR板 将制备的微滴转移至96孔PCR板，用PX1热封仪热封（180℃，5 s）

1.4.4 PCR扩增 用Labcycler PCR仪按照三步法进行扩增（反应条件：95℃预变性10 min；94℃变性30 s，58℃退火60 s，共40个循环；98℃热变性10 min）。

1.4.5 读板 PCR扩增结束后将96孔板置于微滴读取仪中，检测FAM和HEX信号，采用QuantaSoft 1.7.4软件进行数据处理。

1.5 核酸冻融处理

因提取的核酸原液浓度高，超过ddPCR的检测能力范围，因此先将沙门菌和志贺菌的原始核酸用无菌去离子水稀释至0.1～0.5 ng/μL，稀释液各分装 8管，每管 100 μL，分别于室温（20～25℃）、4℃、-20℃、-40℃和-80℃保存。其中，每种核酸在-20℃、-40℃和-80℃各保存2管，一管为处理组（反复冻融并检测），另一管为对照组（不冻融）,冻融周期为1 d，进行10次（即10 d）检测。每次检测时，于固定的时间将-20℃、-40℃和-80℃冻存的处理组核酸置于室温融化，室温和4℃放置的核酸则直接使用；将核酸振荡混匀后短暂离心收集液体，取相同温度保存的1 μL沙门菌核酸和1 μL志贺菌核酸进行双重ddPCR检测；每管每次检测设3个重复孔，3次重复的平均值作为此次检测结果。核酸分装当天（记为“第0 d”）的ddPCR检测值作为起始模板量。10次冻融检测结束后，对3个温度的对照组核酸进行检测。整个实验过程，包括菌株培养、核酸提取及冻融检测，共重复3次。

1.6 统计分析

以核酸提取后未经冻融（第0 d）时每个20 μL反应体系中的靶标拷贝数为基准（100%），计算每次冻融后剩余的靶标比例，后续统计分析均采用换算后的比例数值。用IBM SPSS statistic 21软件对-20℃、-40℃、-80℃条件下，对照组、第1和第10 d的检测结果进行单因素方差分析，α=0.05检验水平上P＜0.05时差异具有统计学意义。对室温、-20℃、-40℃、-80℃保存条件下靶标拷贝数随冻融次数或天数的变化趋势，用Graphpad Prism 8.0.2软件按照单相衰减模型（One phase decay）进行曲线拟合。此模型的公式为y=（y0-plateau）*exp（-K*x）+plateau。其中，y0是x（时间）等于零时的y值，稳定段（plateau）是无限时间的y值，K是速率常数。

2 结果

2.1 靶标拷贝数随冻融次数（或天数）的变化趋势

3次重复试验中，沙门菌和志贺菌靶标拷贝数的初始值（第0 d）均为103～104拷贝/反应，处于ddPCR检测能力范围中结果比较稳定的区间[8]。

不同温度保存的细菌核酸，靶标拷贝数随冻融次数（或天数）的变化趋势不同。4℃保存时靶标拷贝数比较稳定，第10 d的靶标拷贝数为初始值（第0 d）的95.8%（沙门菌）和77.3%（志贺菌）；第1～10 d的10次检测中，拷贝数百分比的值（x±s）为沙门菌91.2%±8.0%，志贺菌89.5%±7.9%。

室温放置的菌株核酸，靶标拷贝数随天数增加而逐渐降低，第10 d的靶标拷贝数下降为初始值的30.7%（沙门菌）和22.4%（志贺菌），与初始值的差异具有统计学显著性（P＜0.05）。

-20℃、-40℃和-80℃保存时，靶标拷贝数随冻融次数的增加而明显下降，第10 d的靶标拷贝数分别下降为初始值的25.3%～31.7%（沙门菌）和8.6%～18.4%（志贺菌），与初始值的差异均具有统计学显著性（P＜0.05）（图1）。3个冻存温度下，经过1次冻融的对照组与第1 d（经过1次冻融）的靶标拷贝数接近或略低，均远高于10次冻融后的拷贝数。

2.2 靶标拷贝数随冻融次数（或天数）变化的拟合曲线

对室温、-20℃、-40℃和-80℃的核酸检测数据，采用Graphpad Prism软件，使用指数回归的单相衰减模型进行曲线拟合，分析靶标拷贝数随冻融次数（或天数）的变化趋势（图2），主要指标值见表1。分析2种细菌核酸衰减的速率常数，室温和-80℃的2条曲线最为接近且数值较小，其次是-40℃曲线，最大的是-20℃曲线。对比核酸衰减的半衰期，室温放置时半衰期（沙门菌/志贺菌）为3.21/3.99 d，-80℃保存时为2.84/3.38次冻融，-40℃保存时为2.09/2.21次冻融，-20℃保存半衰期最短，为1.61/2.06次冻融。但是，对比不同曲线速率常数和半衰期的可信区间，只有沙门菌的室温和-20℃曲线之间的差异具有统计学显著性；其他曲线参数的可信区间互相覆盖，不同曲线之间的差异没有统计学显著性。

3 讨论

图1 同一温度下反复冻融和保存时间对沙门菌（左）和志贺菌（右）靶标拷贝数的影响

图2 不同温度保存的沙门菌（左）和志贺菌（右）核酸，靶标基因拷贝数随冻融次数（或天数）变化的拟合曲线

表1 靶标拷贝数随冻融次数（或天数）变化趋势的拟合曲线主要参数

高质量的核酸是保证检测结果准确的重要前提。低温冷冻保存是标本和核酸长期保存的重要手段，但不同的保存温度、保存时间和冻融次数都会影响核酸的完整性，进而影响核酸检测的准确性[9-11]。本研究以ddPCR方法分析了5个常用的保存温度下，反复冻融和保存天数对2种细菌的靶标基因拷贝数的影响，定量衡量了反复冻融对核酸的损害，并分析了常温和4℃放置时靶标DNA的降解规律。

本研究中，核酸只冻融1次时，在冻存温度（-20℃、-40℃和-80℃）保存10 d（即对照组）与保存1 d的靶标拷贝数相比，数值接近或略有下降，说明对照组相对于第0 d拷贝数的降低主要归因于1次冻融的作用，但保存期内的自然降解也对靶标基因的完整性有一定影响。对照组靶标拷贝数远高于冻融10次时，说明3个冻存温度下第10 d拷贝数的降低主要由多次冻融所致。

菌株核酸在4℃保存时靶标拷贝数比较稳定，第10 d的拷贝数为初始值的95.8%（沙门菌）和77.3%（志贺菌），因此，菌株核酸在4℃短期存放不会明显影响实验室检测结果。不论使用哪个冻存温度，反复冻融都会对菌株核酸产生巨大伤害，靶标拷贝数的半衰期为沙门菌1.61～2.84次冻融、志贺菌2.06～3.38次冻融，10次冻融后，靶标拷贝数仅剩余25.3%～31.7%（沙门菌）和8.6%～18.4%（志贺菌）。即使仅1次冻融，靶标拷贝数也会下降到初始值的71.5%～75.4%（沙门菌）和67.5%～76.1%（志贺菌）。因此，实际工作中如果需要对细菌核酸准确定量，要尽量避免冻融，尤其是反复冻融。在不存在其他引起核酸降解的因素时，10 d内要重复使用的核酸始终放置于4℃可能比经过1次冻融的检测结果更可靠、更接近初始状态。

-20℃、-40℃和-80℃的拟合曲线差异不显著，但2种菌株DNA均表现出在-20℃冻融时拷贝数降低更快的趋势。这可能与冻结速度越慢、水分子结晶存在的时间越长，机械应力造成更多的DNA链断裂有关[12]。

以往也有一些研究探讨保存温度、时间、冻融次数等对核酸检测结果的影响。单增李斯特菌基因组DNA用不同保存液于4℃、0℃和-20℃保存50和100 d，在real-time PCR检测中，-20℃保存时Ct值改变最小，且保存液成分和DNA浓度都对检测结果有影响[13]。纯化的丙肝病毒（HCV）RNA及人免疫缺陷病毒（HIV）RNA在2～8℃条件下放置9 d仍保持稳定[11]。人基因组DNA于4℃放置第3 d时拷贝数下降30%左右，第6 d下降50%；-40℃冻存的粪便DNA反复冻融第4次，其中的人基因组DNA降解具有统计学意义[10]。本研究以沙门菌和志贺菌的DNA为研究对象，获得的数据与以上研究既有相似也有差异，这可能与核酸来源、保存液及检测方法等因素有关。核酸来源不同、核酸分子的大小和形态不同时，例如线性与环状DNA、较大的哺乳动物基因组与较小的DNA病毒核酸等，保存条件对核酸的影响可能会不同。溶解核酸的介质成分、冻融操作程序等因素的改变都可能影响研究结果。另外，如果是对标本或菌株进行检测，保存条件的影响也会与核酸的数据有差异[10]。

综上，在临床诊断和监测，以及基础科学研究中，核酸的保存方式将影响结果的准确性和可比性。本研究可为研究者选择合适的细菌DNA保存方式和评估冻融对试验结果的影响提供数据依据。