奥卡西平特异性抑制胶质瘤干细胞的增殖

刘召丹，陈丽树，满江红

国家生物医学分析中心，北京 100850

脑胶质瘤是人脑最常见的原发性肿瘤，治疗方式主要是手术切除肿瘤后辅助放疗和化疗[1]。Ⅳ级脑胶质瘤为多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM），恶性程度高，通常对放化疗不敏感，患者生存周期仅1年左右[2]。尽管GBM的治疗近年取得一些进展，但这类肿瘤发病率和死亡率仍然很高[3]。胶质瘤干细胞（glioma stem cell，GSC）是胶质瘤中一类具有干细胞特性的肿瘤细胞，具有无限增殖能力和多项分化潜能，被认为与肿瘤的起始、转移和复发密切相关[4]。靶向GSC的治疗方法将会有效治疗脑肿瘤[5]。

新药研发是一个耗时且成本昂贵的过程。与新药研发相比，开发已有药物的新功能具有很多优势，不仅缩短了研发周期，而且降低了开发成本[6]。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物库中的化合物具有较好的生物安全性和明确的靶点信息，应用于开发药物新用途将加快治疗药物的开发速度[7-8]。

奥卡西平（oxcarbazepine）是美国最近引入的抗癫痫药物之一，可有效辅助成人和儿童治疗，并且可作为成人癫痫的单一疗法，与卡马西平（carbamazepine）相比具有更好的耐受性[9]。此外，研究表明奥卡西平对于三叉神经痛和双相情感障碍也具有一定的疗效[10-11]。本研究表明奥卡西平能够特异性杀伤GSC，且对人正常神经细胞影响不大，揭示奥卡西平靶向治疗脑肿瘤的潜能，从而为开发药物新功能提供线索。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常星形胶质细胞（normal human astrocytes，NHA）购自苏州北纳保藏中心；人GSC（T3691、T3832、T387、T4121、D456）受赠于美国加州大学圣迭戈分校Jeremy Rich实验室，并且所有细胞在本实验室都已按照现有方案进行了分离与功能鉴定[12-16]。

B-27血清替代物（B-27 Supplement without vitamin A）、Neurobasal培养基（Thermo Fisher公司；DMEM培养基、胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）、左旋谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素-链霉素双抗（迈晨科技有限公司）；澳洲进口胎牛血清（依科赛生物科技有限公司）；表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（R&D Systems公司）；细胞消化液accutase（Sigma-Aldrich公司）；CellTiter-Lumi发光法细胞活力检测试剂盒（碧云天生物科技有限公司）；奥卡西平（MCE公司）；FDA批准的药物库（FDA Approved Drug Library）购于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心）。

1.2 培养基配制、细胞培养及传代

1.2.1 培养基配制 向500 mL DMEM高糖基础培养基中添加50 mL澳洲进口胎牛血清和5 mL青霉素-链霉素双抗，配制为DMEM完全培养基；向500 mL Neurobasal培养基中添加10 mL血清替代物、5 mL丙酮酸钠、5 mL左旋谷氨酰胺、5 mL青霉素-链霉素双抗、终浓度为10 μg/L的bFGF和EGF，配制为Neurobasal完全培养基。

1.2.2 GSC的培养和传代 GSC为悬浮生长细胞，采用Neurobasal完全培养基，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。当显微镜下观察肿瘤球较大时，吸取培养皿中的细胞悬液至离心管中，900 r/min离心3 min弃上清，用生理盐水重悬细胞，900 r/min离心3 min弃上清，清洗细胞表面残留培养基，用适量accutase重悬细胞，吹打混匀后静置3 min，加入生理盐水稀释终止消化，900 r/min离心3 min弃上清，用Neurobasal完全培养基重悬细胞，转移至合适的培养皿中继续培养。

1.2.3 NHA的培养和传代 NHA为贴壁生长细胞，采用DMEM完全培养基，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。当细胞密度为80%左右时需要处理，吸去培养上清，加入生理盐水清洗表面残留的培养基，弃上清后向培养皿中加入胰蛋白酶，静置2～3 min至轻轻晃动后能观察到细胞脱落，或者在显微镜下观察到细胞悬浮，向培养皿中加入DMEM完全培养基，混匀后反复吹打几次转移至新的离心管中，800 r/min离心3 min弃上清，用DMEM完全培养基重悬，转移至新的培养皿中继续培养。

1.3 化合物筛选

购买的FDA批准的药物库中640种化合物以粉末形式置于8个96孔板中，每种药物10 mmol，用排枪向各孔药物粉末中加入10 μL DMSO溶解药物并混匀；取新的96孔板向对应的孔中加入2 μL药物，确保枪尖上无残留液体；处理T4121和NHA细胞后计数，用对应的完全培养基稀释细胞至每200 μL含有2000个细胞，向96孔板中加入细胞悬液200 μL，使每孔含有2000个细胞，药物终浓度为10 μmol/L；恒温培养4 d后高内涵明场拍照，根据细胞成像进行初步筛选。

1.4 细胞活力检测

将奥卡西平用DMSO溶解后用完全培养基稀释，使终浓度分别为 2.5、5、10、200 μmol/L，加入DMSO的完全培养基为对照组。向96孔板中加入100 μL完全培养基稀释的DMSO和不同浓度的奥卡西平，处理不同种类的GSC和NHA，计数处理，用对应的完全培养基稀释细胞至每100 μL含2000个细胞，向96孔板中加入细胞悬液100 μL，恒温培养4 d 后加入 100 μL CellTiter，吹打混匀12～15次后吸出200 μL混合液转移至黑色96孔板，静置15 min后检测荧光值。

2 结果

2.1 从FDA批准的药物库中筛选到奥卡西平能够特异性抑制GSC增殖

首先，我们向上述药物库中的化合物分别加入T4121 GSC和NHA细胞悬浮液，使药物终浓度为10 μmol/L，恒温培养4 d后对细胞进行高内涵明场拍照。根据高内涵细胞成像，按照图1所示标准对药物库进行初步筛选，最终筛选出15种化合物（表1）能够在10 μmol/L浓度下抑制T4121 GSC增殖且对NHA影响不大。前6种化合物对于T4121 GSC的杀伤作用更明显，我们从中选择了治疗癫痫的奥卡西平作为进一步研究对象。

图1 GSC和NHA生长状态判断标准

2.2 奥卡西平对多株GSC的特异性抑制作用

用不同浓度的奥卡西平稀释液分别处理T3691、T3832、T387、T4121、D456 GSC及NHA，培养4 d后检测细胞活力。随着药物浓度的增加，奥克西平对GSC增殖的抑制作用也不断增加，在浓度为5 μmol/L时已经对多株GSC增殖起到了非常显著的抑制效果，且对正常星形细胞NHA的抑制作用并不明显，浓度为10 μmol/L时这一差别更加显著（图2）。实验结果说明奥卡西平能够比较特异地抑制GSC的增殖，可能为靶向治疗脑肿瘤提供依据。

2.3 奥卡西平的药物作用IC50在NHA中高于GSC

用Graphpad软件计算奥卡西平小分子化合物在不同细胞中的半抑制浓度（IC50），结果如图3。奥卡西平在NHA中的IC50（32.68 μmol/L）远高于GSC（平均值为4.5678 μmol/L），进一步证明了奥卡西平特异性抑制胶质瘤干细胞的潜能。

表1 筛选出的15种能够特异性抑制GSC增殖的化合物

图2 不同浓度奥卡西平处理下GSC和NHA的细胞相对活力

图3 奥卡西平在不同细胞系中的IC50

3 讨论

GBM是最常见、恶性程度最高的原发性脑肿瘤，目前针对GBM采取的治疗方式主要是手术、放疗和化疗，但患者的中位生存期仍然小于16个月[17]。替莫唑胺是常用化疗药物，但作用效果短暂，且只对部分人有效，因此迫切需要改进GBM的治疗方法[18]。GSC对于传统的癌症治疗方法包括放疗和化疗都具有很高的抵抗性，并且是导致肿瘤复发的主要原因[4]。靶向GSC的治疗方法仍有待进一步研究[5]。

奥卡西平是一种新型抗癫痫药物，是卡马西平的10-酮基衍生物[19]，与后者相比具有更好的耐受性，肝脏毒性更低，更加值得临床使用[19-20]。我们通过对FDA批准的药物库进行筛选，鉴定到奥卡西平能够特异性抑制GSC的生长，且对人正常神经细胞影响不大。本研究发现了奥卡西平靶向治疗脑肿瘤的潜能，有望实现旧药新用，为脑肿瘤的临床治疗提供潜在的新策略和新方法。