基于Oncomine及TCGA数据集分析结肠肿瘤中HMGB1基因的表达及预后价值

苏献豪 王会鹏 陈文杰 沈家门 叶桃 蔡元坤

结肠癌（colon cancer）是常见的恶性肿瘤。结肠癌发病率为6.1%，在36种癌症中位于第四位，结肠癌死亡率为9.2%，在36种癌症中位于第二位，仅次于肺癌（18.4%）[1]。结肠癌多由结肠腺瘤（colon adenoma）恶变而来。结肠癌的发生与发展是多基因、多阶段的复杂过程，包括原癌基因的过度激活，抑癌基因的失活，以及基于多基因调控的细胞增殖与凋亡失衡、结肠癌远处转移和局部复发等过程[2]。结肠癌远处转移和局部复发严重影响疾病预后。所以，从基因角度研究结肠癌与腺瘤具有重要意义。

高迁移率族蛋白B1基因（high mobility group protein B1，HMGB1），其编码的蛋白参与触发胞内信号传导，介导肿瘤细胞迁移等过程[3]。研究表明，HMGB1基因在多种肿瘤组织中高表达，且对预后有预测价值[4-8]，但在结肠癌中的表达和预后的研究报道较少。

Oncomine数据库（https://www.oncomine.org/resource/main.）是赛默飞公司开发的商业化的目前世界上最大的癌基因芯片数据库和整合数据挖掘平台[9]。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）收录了33种癌症基因测序数据及相关临床信息[10]。本研究拟从Oncomine数据库和TCGA数据库中提取结肠肿瘤中HMGB1基因表达数据，以探讨HMGB1基因差异表达与结肠癌临床病理参数的关系及对结肠癌的预后价值。

资料与方法

一、数据来源与提取

1.从Oncomine数据库中提取结肠肿瘤中HMGB1基因表达数据，设定搜索条件为：Gene：HMGB1；Analysis Type：Tumorvs. Normal Analysis；Tumor Type：Colon Adenoma，Colon Carcinoma；分析参数：P＜0.05，Fold change=all，Gene rank=top 10%。

2.从TCGA数据库提取数据：利用R-3.5.1软件（Windows版本）TCGA Biolinks函数包从数据库下载并预处理截止至2019年1月8日的结肠肿瘤数据集的DNA和mRNA Seq数据及临床资料数据（随访信息，肿瘤解剖位置）。

3.数据集筛选：剔除随访信息和临床病理参数不完整的病例，共纳入2 191例结肠肿瘤患者（1 073例来自Oncomine数据库，1 118例来自TCGA数据库，其中438例随访信息完整，用于预后分析），患者分布于亚洲（日本、韩国、新加坡）、欧洲（德国、法国、荷兰、波兰、瑞士）和北美洲（美国）。

二、分析步骤

（1）分析结肠腺瘤组织、结肠癌组织与正常结肠组织中HMGB1基因差异表达情况；（2）分析左半结肠癌和右半结肠癌中HMGB1基因差异表达情况；（3）分析黏液性腺癌组织与其他病理类型结肠癌组织中HMGB1基因差异表达情况；（4）比较原位癌与浸润癌、有无淋巴结转移以及有无远处转移结肠癌组织中HMGB1基因差异表达情况；（5）分析HMGB1基因对结肠癌的预后价值。

三、统计学方法

使用R-3.5.1软件进行统计学分析。Shapirowilk法检测数据正态分布情况。组间基因表达差异采用Mann-WhitneyU检验。HMGB1基因表达与患者预后的关系采用Log-rank test，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、结肠腺瘤组织、结肠癌组织与正常结肠组织中HMGB1基因表达情况

结肠腺瘤组织与正常结肠组织比较[11-12]，HMGB1基因表达倍数为1.592，提示HMGB1基因表达上调，差异具有统计学意义（P=4.85×10-16）。

结肠癌组织与正常结肠组织比较[12-19]，HMGB1基因表达倍数为1.717，提示HMGB1基因表达上调，差异具有统计学意义（P=9.43×10-8）。

结肠腺瘤与结肠癌组织中HMGB1基因存在差异表达，结肠腺瘤组织中HMGB1基因表达的平均秩次（945.5）高于结肠癌组织中的基因表达平均秩次（466.0）。

二、左半结肠癌和右半结肠癌组织中HMGB1的表达情况

将纳入的结肠癌患者按照肿瘤原发部位不同分为右半结肠组和左半结肠组。从DNA和mRNA两个水平对各组HMGB1差异表达情况分析。左半结肠癌组织中HMGB1基因的拷贝数高于右半结肠癌（P=0.016），见图1A。在转录水平上，左半结肠肿瘤HMGB1基因的表达量中位数值高于右半结肠肿瘤（P=0.028），见图1B。

三、比较结肠黏液性腺癌和其他病理类型结肠癌组织中HMGB1基因差异表达情况

黏液性腺癌组织中HMGB1基因的拷贝数低于其他病理类型结肠癌组织（P=0.010），见图1C。在转录水平上，黏液性腺癌组织中HMGB1基因的表达量低于其他病理类型结肠癌组织（P=0.022），见图1D。

四、比较原位癌与浸润癌、有无淋巴结转移以及有无远处转移结肠癌组织中HMGB1基因表达情况

浸润癌组织中，HMGB1基因拷贝数（P=0.036）和HMGB1 mRNA中位表达量（P=0.043）均显著高于原位癌；有淋巴结转移的癌组织中，HMGB1基因拷贝数（P=0.042）和HMGB1 mRNA中位表达量（P=0.039）均显著高于无淋巴结转移的癌组织；发生远处转移的癌组织中，HMGB1基因拷贝数（P=0.009）和HMGB1 mRNA中位表达量（P=0.045）均显著高于未发生远处转移的癌组织。见图2。

五、HMGB1基因对结肠癌的预后价值

HMGB1基因高表达结肠癌患者（5年生存率为67%）较低表达结肠癌患者（5年生存率为53%）预后良好，尤其对于女性患者有明显预测价值（P=0.006），HMGB1基因高表达女性患者（5年生存率为73%）较低表达女性患者（5年生存率为46%）预后良好；而对于男性患者则无明显预测价值（P=0.39），HMGB1基因高表达男性结肠癌患者5年生存率为61%，低表达男性结直肠癌患者5年生存率为60%。见图3。

讨 论

结肠癌发病率为6.1%，仅次于肺癌（11.6%）、乳腺癌（11.6%）和前列腺癌（7.1%）；结肠癌死亡率为9.2%，仅次于肺癌（18.4%）[1]。结肠癌发病率高、死亡率高以及趋于年轻化等问题给社会带来了沉重的经济负担。虽然当下国内外各大研究机构、高等院校、医院企业投入大量人员、时间、经费到结肠癌的研究中，但是对结肠癌的生物学行为仍然知之甚少。研究表明，HMGB1基因在多种肿瘤组织中高表达，且能预测预后，如肾细胞癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌等[4-8]，但在结肠癌中预后研究报道较少。

图1 HMGB1基因在不同原发部位、病理类型结肠癌表达差异情况。1A、1B：左半结肠癌和右半结肠癌组织相比HMGB1的差异表达情况；1C、1D：结肠黏液性腺癌和其他病理类型结肠癌组织相比HMGB1基因差异表达情况

图2 HMGB1基因在原位癌与浸润癌、有无淋巴结转移以及有无远处转移情况下的差异表达。2A、2B：HMGB1基因在原位癌与浸润癌中的差异表达；2C、2D：HMGB1基因在癌症有无发生淋巴结转移情况下的差异表达；2E、2F：HMGB1基因在癌症有无发生远处转移情况下的差异表达

图3 HMGB1基因表达对结肠癌预后价值分析。3A：HMGB1基因高表达对438例结肠癌患者预后价值分析；3B：HMGB1基因高表达对204例女性结肠癌患者预后价值分析；3C：HMGB1基因高表达对234例男性结肠癌患者预后价值分析

本研究通过挖掘Oncomine及TCGA数据库中结肠肿瘤患者HMGB1表达矩阵和临床病理信息，分析HMGB1基因与结肠肿瘤原发部位、浸润程度、组织类型的关系及预后价值。发现HMGB1基因在结肠腺瘤和结肠癌组织中均高表达，在结肠癌组织中较结肠腺瘤组织中表达水平更高。HMGB1蛋白可通过癌细胞的主动分泌后，与细胞膜晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、Toll样受体（toll-like receptors，TLR）等结合而触发胞内信号传导，介导细胞增殖、分化以及肿瘤细胞迁移等过程[20]。HMGB1基因在癌组织中高表达可能和癌细胞旺盛的增殖和迁移功能有关。目前较多学者认为左半结肠癌和右半结肠癌应作为两个独立的疾病类型对待，二者在胚胎来源、生理功能、解剖结构、致癌机制和生存预后方面差异较大[21]。本研究发现，HMGB1基因在左半结肠癌组织中较右半结肠癌中高表达。究其原因，可能为左右半结肠胚胎来源的差异造成的。左半结肠包括横结肠左1/3、降结肠和乙状结肠，来源于胚胎期的后原肠。右半结肠包括升结肠和横结肠的右2/3，来源于胚胎期的中原肠。结肠黏液性腺癌约占结肠癌的20%，因该类肿瘤恶性程度高，患者预后差而广受关注。本研究发现结肠黏液性腺癌较结肠癌低表达，相关机制有待进一步研究。根据癌症的浸润深度，未穿透达黏膜下层的成为原位癌。本研究发现HMGB1基因在浸润癌组织中较原位癌高表达。Taguchi等[22]研究发现HMGB1可通过结合RAGE激活MAPK、P42/P44及JNK等信号通路激活基质金属蛋白酶（MMP），继而激活纤维蛋白溶解酶，使得结肠癌细胞更易于突破肠壁中纤维阻隔向下浸润。故浸润癌的HMGB1表达水平较原位癌低。另外，本研究发现HMGB1基因在伴区域淋巴结转移较不伴区域淋巴结转移的结肠癌高表达。Sasahira等[23]研究发现，结肠癌细胞中的HMGB1通过与NF-κB结合上调MIA的表达，后者再激活P38，P38再上调VEGF-C和VEGF-D的表达，从而促进结肠癌细胞淋巴结的转移和新生淋巴管形成。此外，本研究发现HMGB1在转移性结肠癌较非转移性结肠癌高表达。结肠癌的远处转移主要有血行转移、淋巴转移、浸润和种植转移等途径。Treutiger等[24]研究发现，HMGB1可诱发血管内皮细胞E-选择素的表达上调，后者可与肿瘤细胞表达的选择素配体进行结合，肿瘤细胞的血行转移始于该类分子间粘附作用，而且E-选择素能正反馈促进肿瘤细胞释放HMGB1。故HMGB1在转移性结肠癌高表达。Sasahira等[23]的研究从淋巴转移的角度、Taguchi等[22]的研究从浸润和种植转移的角度解释了HMGB1在转移性结肠癌中高表达的现象。HMGB1基因差异表达结果说明HMGB1基因高表达可促进结肠癌的发生发展。

但有文献报道：HMGB1基因有双向调控作用，既能促进癌症的发生发展，又能激活机体的免疫系统发挥抗肿瘤作用[25]。本研究中HMGB1基因对结肠癌的预后价值分析发现HMGB1基因高表达结肠癌患者有更高的5年生存率，尤其是对于基因高表达的女性患者，5年生存率可达73%，较低表达患者（46%）高出27%。HMGB1基因对结肠癌发生与发展的双向调控机制有待进一步研究。国内既往研究对86例结肠癌患者癌组织HMGB1蛋白表达水平进行检测，发现HMGB1蛋白低表达患者的3年生存率明显高于过表达者[26]。究其原因可能是：其一，上述研究采用免疫组化方法检测HMGB1蛋白水平的表达差异，而本研究采用芯片和二代测序结果，评价指标是HMGB1 DNA水平和mRNA水平的表达差异；其二，上述国内研究只纳入86例结肠癌患者，而本研究纳入438例结肠癌患者用于预后分析。

通过对研究结果的综合分析，本研究结论是HMGB1基因可作为判断结肠癌浸润深度、淋巴转移、远处转移及预后的标志物。但该实验研究的不足在于纳入的研究对象集中于亚洲（日本、韩国、新加坡）、欧洲（德国、法国、荷兰、波兰、瑞士）和北美洲（美国）。而未纳入非洲、南美洲等地区的国家数据，存在一定的选择性偏倚。