男性不育实验动物模型建立的研究进展

李怡佳 边艳超 李 硕 肖 瑞

内蒙古医科大学内蒙古自治区分子病理重点实验室，内蒙古呼和浩特 010059

男性不育是一种多因素病理状况，影响全球约75%的男性。阐明男性不育遗传机理的研究发现了许多关键途径。例如，在性分化减数分裂过程中，由于减数分裂过程的复杂性，大量基因被认为参与了减数分裂过程的调控。这一过程中存在的缺陷可能导致减数分裂失败、产生非整倍体配子和不育。非整倍体配子可以导致胚胎死亡或后代发育缺陷[1]。目前男性不育的临床治疗主要依靠辅助生殖技术，但其存在费用高、操作繁琐以及高多胎率等一系列亟待解决的问题。因此，研究男性不育的发病机制并针对病因给予治疗是今后的主要研究方向。本文对常见物理方法、化学方法、手术方法及基因敲除方法进行总结。

1 物理方法

1.1 热刺激

哺乳动物中，睾丸温度低于体温的2～8℃是精子发生的前提条件[2]。睾丸温度异常升高使代谢加快，需氧量增加，破坏平衡的氧化稳态，致使精子损伤，导致不育。温度越高，加热时间越长，对生殖能力的损害越大。这种高温诱发的精子损伤是可逆的。已有多篇文献报道通过热刺激来建立不育模型，处理的方法有水浴加热、高温照射、红外线、激光等，考虑到可操控性及安全性，水浴加热最为常用。

Hamilton 等[3]通过对公羊睾丸连续加热288 h 并持续9 周收集精液后，发现精子运动性、活力和质量运动性均降低。在第5 周时，缺陷精子的数量显著增加，具体表现在膜和顶体受损的精子百分比增加；完整的膜和顶体的精子百分比降低；完整的膜和受损的顶体精子百分比升高。Paul 等[4]发现公羊精子接受14 d或28 d 的热刺激后可观察到顶体和质膜损伤。但从第6 周开始，实验组的公羊精子与未受热刺激的公羊精子比较，差异无统计学意义（P >0.05），提示精子的损伤程度与热刺激的时间和温度呈正相关，但在一定程度上是可逆的。这可能是因为热刺激后公羊睾丸中的抗氧化剂（HMOX1、GPX1 和GSTA）表达增强，氧化应激失衡导致的氧化稳态被破坏[3]，这种损伤会持续约1 个精子周期（47 d）。

刘安娜等[5]收集了71 例高温环境男性工作者（厨师、电焊工、锅炉工）的精液进行对照研究，发现长期暴露于高温环境中，男性的精子密度、精子活率明显下降，精子畸形率明显升高，且暴露时间越长，症状越明显。持续高温导致睾丸内环境和生精微环境改变，造成生精细胞脱落、曲细精管萎缩。随着热暴露时间的延长，附睾精子出现胞浆小滴，精子运动速度增快，未成熟精子被排出，并产生失活精子和各种畸形精子。Rao 等[6]将两组试验者以不同频率在43℃水中进行水浴。通过观察发现试验者精子密度及总精子数均明显降低，精子运动性、低渗肿胀试验评分和总顶体酶活性增加，但其是可逆的。与连续热暴露比较，反复间歇性热暴露更严重地抑制精子发生，具体表现在恢复时间更长，程度更重，这可能是由于间歇性热暴露会在精子发生的多个阶段产生影响。

1.2 辐射效应

男性生殖细胞对电离辐射、辐射热及有毒物质敏感。经X 线照射的小鼠睾丸组织中[7]可观察到睾丸组织、生殖细胞的形态，DNA 含量均发生变化。经X 线照射后小鼠睾丸重量减轻，睾丸生精小管内精原细胞和初级精母细胞变性坏死，细胞质减少、核固缩，细胞膜破裂，坏死脱落。生精小管形状不规则，管腔间隙增大,生精细胞层数明显减少，管腔内成熟精子占比减少甚至消失。精子及生精细胞DNA 链发生断裂，影响生精功能。

Zhang 等[8]将小鼠精母细胞衍生的GC-1 细胞暴露于环境射频场和X 线中发现，共同照射下的细胞较单独暴露于X 线的细胞增殖水平显著降低并且凋亡率显著增加，Bcl-2 蛋白表达水平显著降低以及Bax 蛋白表达增高，可观察到生精小管的结构、精子形态及数量和抑制生殖细胞增殖等方面的改变。提示Bcl-2 和Bax 可能参与辐射诱导生精细胞凋亡的机制，环境射频场虽然不会对男性生殖能力有影响，但可加剧X 线诱导的细胞抑制增殖。

2 化学方法

2.1 化疗药物

近几十年来，化疗药物的发展使癌症患者的存活率急剧上升，但也因此出现生育问题。环磷酰胺（CTX），顺铂（CIS）和多柔比星（DOX）是临床常用抗癌药物。这些药物通过对生发上皮内特定细胞的选择性损伤，阻碍精子成熟障碍，损伤支持细胞或上皮样间质细胞等，使正常的微环境受到破坏，影响精子产生。已有研究[9]显示青春前期的孩童接触这些化疗药物会影响生育能力，幸存的男性受孕概率降低，且单独和联合使用药物差异无统计学意义（P >0.05），女性妊娠的可能性及活产率均明显降低。

Smart 等[10]发现将青春前期小鼠睾丸组织碎片分别培养于临床治疗浓度的CTX 活性代谢物磷酰胺芥末、CIS 及阿霉素中，观察到这3 种药物均导致小鼠睾丸组织中包括精原干细胞在内的生殖细胞特异性及显著性丧失，但体细胞没有受影响。暴露于高浓度CTX 和DOX 中，95%的小管缺乏生殖细胞或大量细胞坏死；高浓度CIS 组在此基础上同时并有生精小管的直径减小。很多学者研究了大量化疗药物对青春后期啮齿类动物的性腺毒性，结果表明暴露于CTX、CIS、DOX 均导致精原细胞及精母细胞数量降低，并且CTX 不仅造成精原干细胞的死亡，存活干细胞中产生的精子也可能表现出一定程度的功能和DNA损伤[11]。

2.2 棉酚

鱼精蛋白是成熟精子的主要核蛋白，其主要作用是浓缩精子细胞核，保护精子遗传信息，通过组蛋白-鱼精蛋白取代反应使精子细胞核高度浓缩[12]。醋酸棉酚能够破坏曲细精管中的精子细胞和精母细胞，干扰大鼠HPRR 及精核蛋白含量，抑制精子的发生过程，在大部分临床不育患者中均存在HPRR 及精核蛋白异常。

Santana 等[13]研究显示，棉酚会对精子运动及形态产生影响。大鼠灌胃给药剂量为5 mg/kg 的棉酚乙酸混合液，实验组大鼠的后代数量为零，附睾精子数量减少，谷胱甘肽过氧化物酶活性显著增加，睾丸中GSH 的浓度显著降低。El-Sharaky 等[14]对大鼠注射不同剂量的棉酚乙酸混合液，各剂量组大鼠生育能力均被影响，精子呈现不同程度的形态异常及运动性降低，睾丸间质细胞和支持细胞被完全破坏，精子数量减少，浓度降低。同时大鼠肝脏组织病理切片存在亚急性或慢性肝损伤。棉酚损伤动物模型对临床用药剂量的选择有重要意义，适当剂量不仅能将药物的副作用减弱，也能减少对其他组织脏器的损伤。

2.3 雷公藤多苷

雷公藤多苷干扰大鼠睾丸初级精母细胞DNA 合成，使睾丸萎缩，各级生精细胞变性、坏死、数量减少，其中以精子、精母细胞和次级精母细胞最敏感；附睾精子畸形率显著提高，精子头尾分离、无钩、颈尾弯曲、无定形现象显著增多[15]，但低剂量雷公藤多苷的作用是可逆的。

按30 mg/kg 的剂量灌胃SD 大鼠8 周[16]后大鼠精子密度及活性显著降低，精子细胞质和线粒体Ca2+含量显著降低，经治疗30 d 后显著恢复。以30、40、50 mg/kg 剂量的雷公藤混悬液分别灌胃SD 大鼠3～5 周后，大鼠睾丸的质量、精子计数、精子活动率以及睾丸组织Makler 评分（testicular Makler score，TMS）随剂量或灌胃时间的增加而持续降低。停药后，低、中剂量组指征略有恢复；50 mg/kg 组未见恢复。给予雌性昆明小鼠50 mg/kg 雷公藤多苷后[17]可观察到小鼠的发情期时长增加，但发情频率显著降低，雌性小鼠子宫内膜变薄，并诱导卵巢早衰。

2.4 腺嘌呤

腺嘌呤在动物实验中通常是用来诱发慢性肝、肾功能损害模型。在腺嘌呤诱导的慢性肾损伤早期Wistar 大鼠[18]中发现腺嘌呤通过抑制17β-羟基类固醇氧化还原酶产生抑制睾酮的合成。连续30 d 对大鼠灌胃200 mg/kg 剂量的腺嘌呤[19]，观察到大鼠的交配数量并使交配潜伏期延长，且睾丸重量减少，精子密度和精子活力降低以及睾丸中的酸性磷酸酶（ACP）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、乳酸脱氢酶（LDH）和γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）活性降低，经果糖二磷酸锶盐治疗后可恢复。

3 手术方法

3.1 实验性隐睾

Li 等[20]对10 日龄的昆明小鼠进行诱导隐睾手术35 d 后发现精液中仅存在精原细胞和初级精母细胞，提示隐睾可能使精子的发育停滞在初级精母细胞阶段。对小鼠进行单侧隐睾手术[21]，两侧对比效果更为明显。手术侧全部生精小管均显示出萎缩和塌陷，在生发上皮中存在严重的退行性变化，并且所有阶段都未出现晚期生殖细胞。

隐睾症的手术诱导模型是经常被用作研究睾丸组织热应激的模型[22]，提示隐睾症导致小鼠生育能力的降低机制与热应激相似，都与高温引起的抗氧化酶活性下降有关。

3.2 手术致精索静脉曲张

精索静脉曲张一直被认为是导致男性不育的原因之一。Saypol 等[23]对大鼠和狗进行了精索静脉曲张实验，术后大鼠和狗的睾丸血流量增加，睾丸温度升高，需氧量上升，成熟精子生精小管百分比下降，睾丸生殖细胞凋亡程度加重，同时睾丸萎缩。

4 遗传因素

4.1 X 线修复交叉互补组1（Xrcc1）基因敲除

Xrcc1 是一种重要的DNA 修复基因，在精子发生早期高度表达[24]，以维持基因组稳定性。Xrcc1 基因敲除小鼠与野生型小鼠比较，睾丸体积更小，精子浓度降低且精子活性减弱；生精小管数量减少，管壁层数缺失和上皮细胞紊乱。Xrcc1 缺乏会诱导睾丸活性氧水平升高，线粒体功能障碍，使细胞凋亡、损害精子和丧失精原干细胞。Xrcc1 敲除的精原干细胞体外实验发现抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸孵育细胞24 h 可以部分逆转损伤，但不能恢复生育能力或改善细胞凋亡。

4.2 雄激素受体（AR）基因敲除

雄激素和AR 促使睾丸发挥正常生理功能，在小鼠睾丸体细胞及精子细胞中广泛表达，缺乏则会发生睾丸女性化综合征。AR 基因特异性敲除小鼠生殖细胞发育不完整并伴有数目减少分裂迟缓，血清睾酮水平降低，从而导致无精子症及不育[25]。敲除小鼠睾丸中虽然仍有正常生殖细胞，但AR 基因敲除致使某些基因不能正常表达，难以维持支持细胞生理功能和管周肌样细胞正常收缩，影响正常的精子发生和排出[26]。

4.3 Piwi 基因突变

Piwi 基因最早在果蝇卵巢中被发现，以维持生殖系干细胞（GSC）发育。在小鼠睾丸中3 个Piwi 同源基因均表达，且都与雄性生育能力有关[27]。Gou 等[28]在脊椎动物Piwi 蛋白的N 端结构域中发现了一个保守的破坏框（D-box），在小鼠精子发生晚期，Miwi 蛋白依赖D-box 被泛素化和降解[29]。

在特异性D-box 突变敲入小鼠中[30]，Miwi 蛋白水平升高，表现为雄性全部不育，而雌性均表现出正常的生育能力。雄性突变小鼠睾丸平均重量降低25%，精子数量减少，丧失运动能力，且形态异常，大多数表现为向背弯曲。精子染色质压缩较少，只在晚期精子细胞中观察到广泛凋亡信号。Miwi D-box 区域缺陷更为严重。敲入小鼠Miwi 蛋白水平的升高，会直接抑制泛素连接酶的活性，晚期精子细胞中Miwi 蛋白无法被降解，组蛋白与鱼精蛋白交换不完全，精子功能受损[31]。

5 总结

不育人数逐年上升，且有高达30%～40%的患者病因不明。利用动物模型深入了解男性不育的病因和潜在的分子机制将为临床治疗提供依据。

在众多造模方法中，化学方法最为经济、快捷、简便，是目前研究机制较为成熟且适用最广的。但其缺点在于，有些化学药物对实验动物的脏器有损伤，且部分化学药物的使用剂量没有统一的定论，使得成模率降低，造模死亡率上升。物理造模方法操作简单，并且损伤部位针对性强，但是损伤程度不够彻底，部分方法模型生殖能力会主动恢复，不够稳定。基因敲除虽然指向性明确，但成本高昂，操作难度大，难以广泛使用。手术方法造模，病变部位明确，与其他方法比较，不会造成其他脏器的损伤。这些造模方法各有优劣，研究者可根据实验目的和实验室条件选择合适的造模方法，为男性不育的临床诊治提供研究基础。