梅毒非特异性抗体再认识

夏德菊，许四宏，尹跃平

作者单位：210042 南京，中国医学科学院皮肤病医院/中国疾病预防控制中心性病控制中心（夏德菊、尹跃平）；100050 北京，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂研究所（夏德菊、许四宏）

梅毒是由梅毒螺旋体（treponema pallidum，TP）感染引起的慢性、系统性性传播疾病[1]。中国是梅毒高流行地区，据估计，全国有近三百万梅毒患者，占全球梅毒感染者的15% 以上[2]。因为 TP 不能体外培养，其病原学检测仅适合于一期、二期等有皮损症状的梅毒、且敏感性较低，所以梅毒诊断主要依靠血清学试验，包括梅毒螺旋体特异性抗体检测（梅毒螺旋体血清学试验）和梅毒螺旋体非特异性抗体检测（非梅毒螺旋体血清学试验）[3-4]。前者主要针对梅毒螺旋体多肽抗原产生特异性的抗体，此类抗体产生较早，抗TP IgM 和 IgG 抗体可在梅毒感染 2 周和 4 周后产生，特异性抗体一经产生一般可终身维持阳性，不受梅毒病程和治疗情况的影响[5]；梅毒螺旋体非特异性抗体一般在梅毒感染 6 周左右出现，传统上结合梅毒螺旋体特异性抗体检测用于梅毒的诊断以及用于随访治疗效果[6]。随着近些年临床使用大数据信息分析以及一些学者的深入研究，发现梅毒非特异性抗体检测意义较传统认识上有新的发现，现综述如下。

1 梅毒非特异性抗体的来源

梅毒非特异性抗体是于 1901年由 Wassermann 发现，因此早期也叫 Wassermann 抗体，亦称之为反应素[7]。该抗体识别的是脂质抗原，主要是通过卵磷脂、心磷脂和胆固醇混合物来检测，其中心磷脂是主要抗原组分[8-10]。此类抗体的来源一直存在很大争议，主要分为两派，Eagle 等学者认为反应素是针对梅毒螺旋体的磷脂组分而产生，证据为大量的临床特异性数据[11-13]，且 TP 所含的脂类是蛋白的 1.3 倍，67.8% 为磷脂[14]。但反对意见认为任何动物或者人的组织都可以作为此类抗体的抗原，而且确实有一些未感染梅毒的人血清中也会检测到反应素，因此以 Sachs 为代表的一些学者认为 TP 感染后引起宿主细胞破损，释放组织半抗原，然后经 TP 蛋白活化成为全抗原，刺激机体产生自身免疫反应[15-17]。然而最近由厦门大学杨天赐教授团队利用兔子感染模型证实，非特异性抗体的产生可能是由 TP 和宿主细胞的磷脂抗原共同参与诱导出的，研究表明 TP 自身磷脂抗原免疫原性很弱，只能刺激机体产生低滴度的梅毒非特异性抗体，而受损的宿主细胞磷脂抗原在刺激机体产生高滴度的反应素方面发挥重要作用[18]。该团队分别利用灭活的TP、心磷脂和心磷脂-BSA 混合物、有活性的 TP 分别免疫兔子，结果发现灭活 TP 免疫组能产生非特异性抗体但滴度很弱（大多为 1:1 或者弱反应性），考虑到心磷脂具有抗原性，可能的原因是 TP 自身磷脂抗原免疫原性很弱。因为单独心磷脂免疫组不能产生抗磷脂抗体，而心磷脂-BSA混合物免疫组能够产生抗磷脂抗体，因此 TP 自身磷脂抗原免疫原性弱可能是因为未结合蛋白成分；加之之前研究发现 TP 外膜蛋白破损后也可以标记上 Wassermann 抗体，提示心磷脂抗原可能存在于 TP 的内膜[8]，这也可能是 TP自身磷脂抗原免疫原性弱的一个原因。该研究还发现灭活的梅毒螺旋体免疫组的抗体反应模式显著不同于活性的梅毒螺旋体免疫组，后者可以更快诱导出更高滴度的梅毒非特异性抗体，且抗体是持续增长的，原因可能是活性 TP 可以持续增殖并破坏宿主细胞。且有研究发现，TP 的脂肪酸成分和感染组织相似，提示宿主来源的磷脂和其他脂类可能组合到梅毒螺旋体中，形成一个独特的表位进而刺激产生梅毒非特异性抗体[16]。但究竟 TP 蛋白是否参与并增强了心磷脂的抗原性并未得到证实。

2 梅毒非特异性抗体的经典生物学假阳性

目前梅毒非特异性抗体的检测方法主要有快速血浆反应素试验（RPR）、梅毒甲苯胺红不加热血清反应素试验（TRUST）以及性病研究实验室试验（VDRL），其原理基本相同，均采用牛的心磷脂为抗原，与卵磷脂和胆固醇按照一定的比例进行混合，组成 VDRL 抗原颗粒，当抗原与反应素相互作用时，出现凝集反应[9]，但这些方法在非梅毒患者也能检测出梅毒非特异性抗体，传统上将此现象称为梅毒非特异性抗体的经典生物学假阳性（classical biological false-positive，CBFP）。有大量研究表明，梅毒特异性抗体检测方法和非特异性抗体检测方法都存在偶发性生物学假阳性，但前者发生 CBFP 的概率要显著低于后者[9,19-20]。通过大量临床样本的回顾性分析发现梅毒非特异性抗体检测方法在自然人群中发生 CBFP 的概率为 1%～2%[21-23]，其中主要和自身免疫疾病患者、HIV 感染者、孕妇以及静脉注射毒品者关联显著[4]，而且女性 CBFP 发生率要高于男性，可能原因一方面是因为女性妊娠，其次是某些自身免疫疾病如系统性红斑狼疮的发病率女性要显著高于男性[21,23]；再者 60 岁以上人群的 CBFP 发生率要高于其他年龄组，可能是和这个年龄组人群的血清异常成分如抗核抗体、类风湿因子以及高丙种球蛋白等因素的增加有关[24-25]。一般认为低滴度的非特异性抗体人群易发生 CBFP，但高滴度的非特异抗体也有发生[25]。杨天赐团队[26]发现，CBFP 的发生还和假孕、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血、先天性心脏畸形、输卵管炎和包皮过长的发生有关，其研究结果提示：假孕和再生障碍性贫血导致免疫球蛋白的升高，和抗磷脂抗体产生交叉反应；巨幼细胞性贫血和先天性心脏畸形可能导致宿主细胞受损，释放磷脂抗原，进而产生假阳性反应[27]；输卵管炎和包皮过长可能和细菌感染有关，因为细菌感染可能导致心磷脂三种抗体亚型血清水平的升高[28]。传统上，根据 CBFP 的持续时间，分为急性 CBFP（小于 6 个月）和慢性 CBFP（大于 6 个月）[28]，杨天赐团队发现，急性CBFP 主要和巨幼细胞性贫血有关，而慢性 CBFP 主要和再生障碍性贫血、先天性心脏畸形有关，但是在健康人群中，两者都有发生，尤其是老年人和孕妇[26]。

3 梅毒非特异性抗体的异质性

梅毒非特异性抗体主要是识别心磷脂抗原产生抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody，ACA），如上述 CBFP 的发生主要和抗磷脂抗体综合征（antiphospholipid syndrome，APS）和自身免疫疾病相关[4]。已知 APS 和自身免疫疾病检测的 ACA 主要是 β2-GPI 依赖型，即抗原抗体的结合反应需要 β2 糖蛋白；而感染性疾病血清中检测到的 ACA 主要是 β2-GPI 非依赖型[29-31]，因此探究梅毒患者和发生CBFP 的患者血清中的 ACA 是否一致对解释 CBFP 的发生起着关键作用。杨天赐团队[32]选取了 146 例 CBFP 患者（排除和APS 相关的患者），465 例梅毒患者（排除其他感染性疾病和自身免疫病）和 64 例 APS 患者（排除梅毒感染和自身免疫病），对血清中的 β2-GPI 依赖型 ACA 进行检测，研究发现在 CBFP 患者组 β2-GPI 依赖型 ACA 的阳性率为 22.6%，和 APS 患者组无明显差异，但梅毒患者组的 β2-GPI 依赖型 ACA 的阳性率仅有 3.87%，此水平在健康人群中的阳性率范围内（1%～5%）。且非特异性抗体滴度水平和 β2-GPI 依赖型 ACA 的阳性率水平并无相关性，提示梅毒患者主要产生的是 β2-GPI 非依赖型 ACA，β2-GPI 依赖型 ACA 在 CBFP 患者中占据很大比例，所以梅毒患者和 CBFP 患者中的 ACA 具有异质性。

4 梅毒非特异性抗体的前带现象

前带现象主要指高滴度的梅毒非特异性抗体干扰了抗原-抗体形成晶状网格体进而形成肉眼可见的凝集反应，导致假阴性反应，有研究者称之为“hook 效应”。前带现象一般是因为血清未经稀释引起，并且可以发生于梅毒感染的各个阶段[4]，有研究表明，此现象在梅毒人群的发生率为0.2%～2%[33-34]。一般认为，前带现象主要由高滴度的梅毒非特异性抗体引起，但是有最新研究发现中等滴度以及弱滴度的非特异性抗体也能产生前带现象[9]。杨天赐团队[35]通过对 46856 例梅毒患者样本的回顾性分析也证实前带现象发生率为 0.83%，且大约 31% 的前带现象样本的 RPR 滴度小于 1:16。而且大量研究发现前带现象还和二期梅毒、早期潜伏梅毒、神经梅毒[4]、HIV 感染[35-36]以及妊娠有关[37-38]，其中 HIV 感染可能和 B 细胞异常活化导致高浓度抗体产生有关，而二期梅毒和早期潜伏梅毒可能和高滴度的梅毒非特异性抗体产生有关，但神经梅毒和妊娠人群中前带现象升高的原因还有待进一步探究。为了消除前带现象，需要对样本进行稀释后检测，但部分实验室为了节约人力和成本，并未严格用稀释样本来检测，因此指导临床医生对梅毒疑似患者要结合梅毒非特异性抗体滴度检测结果进行综合判断。

5 梅毒非特异性抗体的血清固定现象

青霉素用于梅毒治疗已有 50年的历史，其治疗效果的评价一直以来都是通过梅毒非特异性抗体滴度的变化进行监测[39]，因为有大量研究表明梅毒患者经过足够正规程序治疗后，其非特异性抗体会下降，传统上认为抗体滴度有4 倍增长或下降代表着感染或治疗有效，但是部分梅毒患者经驱梅治疗 1年后，其非特异性抗体在很长的时间内一直持续于低滴度的状态而不转阴（或未出现 4 倍增长或下降），此现象称为血清固定或血清抵抗[40-42]。该现象的发生机制以及影响因素一直以来都很困扰临床医生，早期研究主要集中于 HIV 感染梅毒患者的治疗效果评价，发现 HIV感染者梅毒治疗依从性不好，非特异性抗体下降缓慢[43-44]。近些年有研究者分别进行了非 HIV 共感染的不同临床阶段的梅毒患者治疗效果的评价，发现病程、性别、年龄和起始非特异性抗体滴度和血清治疗效果相关[3,44]。对于许多梅毒患者，血清应答状态随着治疗过程的变化而变化，所以时间点的选取对于评价治疗效果很关键[45]，一般对于早期梅毒患者，治疗后 6 个月内梅毒非特异性抗体滴度至少有4 倍下降或转阴，对于潜伏或晚期梅毒患者，治疗 12 个月内梅毒非特异性抗体滴度至少有 4 倍下降或转阴，这些称为血清治愈[46]。有研究称 15%～20% 的早期梅毒患者在治疗后 6 个月会出现血清固定[44-45]，杨天赐教授认为血清固定发生率在一期梅毒、二期梅毒、隐性梅毒、三期梅毒中逐渐递增，且其发现在治疗的前 6 个月血清治愈率随着时间上升而上升，但 6～12 个月，血清治愈率变化不大，提示血清固定现象不会随着时间延长而下降，所以梅毒治疗的评估建议随访至 12 个月[3]。老年人的血清固定现象明显升高，可能和老年人免疫系统削弱和免疫抑制的增强，进而影响了梅毒治疗过程中抗体的应答反应有关[47]。许多研究表明有较高基础滴度（>1:8）的梅毒非特异性抗体患者发生血清固定几率会降低，可能高滴度的起始抗体预示着宿主对TP 的免疫应答更强烈，更有助于清除 TP，杨天赐教授也证实了这一点，但 Seña 则发现较低滴度（≤ 1:32）的非特异性抗体更容易出现血清治愈甚至转阴，因此一些专家认为治疗后血清固定的发生可能因为机体持续的免疫应答反应而不是因为宿主细胞里残余的 TP[47]，因此对非特异性抗体滴度与病原体感染压力和机体免疫应答的关系的探究有助于理解梅毒治疗后抗体变化规律。上海皮肤病医院的周平玉教授认为判断梅毒血清固定应先排除治疗不规范和再感染，梅毒血清固定是一种梅毒螺旋体感染过程中的特有免疫状态，增加治疗剂量和次数并不能改变其血清固定的事实，因此无需过度治疗[48]。也有学者认为血清固定和用药类型、剂量和注射方式有关，与机体的免疫功能有关[49]。王千秋团队发现血清固定还和细胞因子以及 TP 亚型有关，对早期梅毒患者治疗后的 12 个月随访发现，血清固定组的驱化因子和 14i/a 基因型占比较高[50]。近年来发现神经梅毒与血清固定现象关联显著，一项 205 例的血清固定人群的调查发现有 56.1% 的患者为神经梅毒，提示在经过 6～12 个月的治疗后出现血清固定的人群要考虑神经梅毒的可能性[51-52]。

6 梅毒非特异性抗体的筛查诊断价值

由于梅毒非特异性抗体是梅毒感染后最初发现的一种抗体，早期认为其来源为针对梅毒螺旋体的磷脂组分而产生，具有较高的特异性[9]，加之检测此抗体的方法简单、成本低廉，所以梅毒非特异性抗体实验最早用于梅毒的初筛。但随着对非特异性抗体的认识提高以及梅毒特异性抗体检测方法的实现，为了提高诊断特异性，梅毒诊断采取了串联试验策略，即用非特异性抗体试验进行初筛，出现阳性再用特异性抗体检测进行确认，该程序也称为梅毒传统诊断程序[6,53]，该诊断程序被美国 CDC 和我国《性传播性疾病临床诊疗指南》（2007年）推荐使用。但如前所述，非特异性抗体检测方法面临较高的经典生物学假阳性现象和前带现象，且有文献报道，一期梅毒以及晚期隐性梅毒中非特异性抗体方法检测敏感性较低，导致了梅毒筛查的假阳性和假阴性问题。González 等[54]曾采用传统的诊断程序对 792 例梅毒筛查血清进行检测，发现有 22 例梅毒患者造成漏诊。杨天赐教授团队在 24 124 例梅毒检查中，临床确诊了 2749 例梅毒患者，其中 665 例患者非特异性抗体阴性而特异性抗体阳性。如果采用传统诊断程序，这 665 例梅毒患者将被漏诊，漏诊率高达 24.2%[55]。因此，美国公共卫生实验室协会、英国健康保护局、国际性传播感染联合会以及欧洲大多数国家目前推荐梅毒逆序诊断程序[56-58]，即以一种梅毒特异性抗体试验进行初筛，阳性再用非特异性抗体方法确认，如果结果不一致再用另一种特异性抗体试验复核，该程序显著提高了梅毒诊断的特异性和灵敏度，而且现在很多特异性抗体检测方法均实现了自动化和高通量检测，大大降低了人工劳动成本。梅毒逆序诊断程序目前在国内也得到了很多专家认可，新版《性传播疾病实验室检测指南》也推荐使用。但是杨天赐教授团队通过一个大数据量的横断面调查研究（总共对 24 124 例进行检测，梅毒患病率为 11.4%）发现，如果将逆序诊断程序中的梅毒非特异性抗体试验去除，该程序和逆序诊断程序均有较高的准确度，可达 99.93%，两者一致性（Κappa 值）为 0.996[55]。该团队认为，在排除了传统生物学假阳性后，非特异性抗体阳性的患者，其特异性抗体一定阳性；而特异性抗体阳性的患者，其非特异性抗体不一定阳性，因此，逆序诊断程序中特异性抗体初筛后，再用非特异性抗体做确认，可能是多余的试验，非特异性抗体实验更适用于临床梅毒治疗效果的监测，该程序已被 2014年的欧洲指南以及 2015年的加拿大公共卫生实验室指南所推荐，所以其称为 ECDC 诊断程序[4,59]。但该诊断程序只在梅毒高发病人群进行了验证，在低流行地区该诊断程序是否依旧有较高的准确性还有待考量。在我国，梅毒属于乙类传染病，是我国血源筛查的必检项目，所以梅毒血源筛查试剂不同于临床诊断试剂（按照医疗器械实行注册检验）是按照药品进行严格管理，实行批签发，梅毒非特异性抗体检测试剂由于历史原因最早用于血源筛查，至今一直实行批签发，每年耗费大量人力和物力成本，但考虑到该试剂的敏感性以及特异性可能对我国血液的安全性和利用率的影响，加之逆序诊断程序在国内的认可，目前梅毒非特异性抗体检测试剂已极少用于血源筛查，所以该试剂批签发模式有待考量。

7 梅毒非特异性抗体的治疗监测价值

由于 TP 不能体外培养，因此梅毒治疗效果的评价一直以来没有金标准，但有很多文献证实梅毒非特异性抗体滴度变化和梅毒治疗过程相关性很高[4,9,44,60]，所以各个国家的梅毒诊疗指南中，都将梅毒非特异性抗体滴度的下降作为治疗有效性的一个指标，但如前述，血清固定人群的处理一直都困扰着临床医师。近些年陆续有学者发现和传统认识有冲突的地方：周平玉教授发现未经治疗的梅毒患者也会出现非特异性抗体滴度 4 倍下降；17 例二期梅毒患者即使经过了足量的驱梅治疗且非特异性抗体滴度有 4 倍下降，但仍然发展为神经梅毒[61]；Holman 等[62]发现大约 20% 的梅毒患者在经过 14 天的正规治疗后非特异性抗体不仅没有降低反而升高，这些发现越来越冲击非特异性抗体的治疗监测作用。因此杨天赐教授团队第一次利用兔子模型评价 TP自然感染过程和青霉素治疗后的非特异性抗体的滴度变化，研究发现无论是否经过青霉素治疗，感染兔子的非特异性抗体都是先升高然后降低，有的甚至会转阴，非特异性抗体滴度的这种变化更像是在梅毒感染过程中一个自然免疫过程[63]。该团队利用兔子感染试验（RIT），即在感染第 30、60 和 180 天取兔子腘窝淋巴结，用生理盐水抽提，然后免疫新的兔子观察抗体阳转和感染症状以评估是否存在活性梅毒并评估治疗效果。研究发现在治疗组 30 天虽然大部分兔子的非特异性抗体未有 4 倍滴度下降，但 RIT 均为阴性，提示治疗有效；而在非治疗组，绝大部分兔子在感染第30、60 和 180 天的 RIT 为阳性，提示仍有感染力，但是大部分兔子的非特异性抗体滴度已经有 4 倍降低，所以综合考虑，非特异性抗体滴度 4 倍降低和治疗有效性的相关性值得进一步探索，但是兔子试验能否代表真实的人体感染状态尚有存疑，而且招募梅毒感染患者不进行治疗以观察血清学变化是不人道而且有违伦理，直接用 TP 感染人体更是道德丧失，所以寻找一个有效的评估梅毒治疗效果的监测指标还有很长的路要走。

8 梅毒非特异性抗体新探索

有研究发现，非特异性抗体的滴度和神经梅毒的发生率相关，上海复旦大学的卢洪洲教授和 Libois 认为梅毒和 HIV 共感染人群的 TRUST 抗体滴度在 1:16 或 1:32以上是无症状神经梅毒进行腰穿取脑脊液检测的一个指标[64-65]；而杨天赐教授认为在 HIV 阴性的梅毒感染人群中，神经梅毒的发生除了和非特异性抗体滴度相关外，和特异性抗体 TPPA 的滴度也显著相关，其认为 RPR 抗体滴度在 1:4 以上且 TPPA 的滴度在1:2560 以上，是判断HIV 阴性的梅毒感染人群是否发生神经梅毒的一个有效指标，能大大降低不必要的侵袭性腰穿[66]。目前，非特异性检测方法均为手工操作，临床使用增加了大量人力成本，已有部分研究采用了自动化检测方法，FDA 已批准两个自动化的非特异性抗体检测试剂，和传统手工检测方法相比，自动化检测方法一致性较好，其中获批的伯乐试剂的一致率为100%，阳性预测值范围为 95%～100%，阴性预测值范围为99.1%～100%[67-68]，而且大大节省了人力、提高了通量，但其在定量滴度检测时还有一定局限性，不能对每一份样本进行终点滴度的检测。此外，及时的诊断和治疗是防止梅毒进一步扩散的必要条件，尤其是胎传梅毒，但在一些非洲国家，治疗资源有限，因此快速区分现症感染和既往感染或治疗后梅毒具有重要意义。所以近些年梅毒特异性抗体和非特异性抗体双通道快检试剂已陆续开发研究，在多个国家对美国的一个商品化的梅毒筛查和确诊试剂进行评估，结果显示和参比试剂相比，特异性和灵敏度均较好，但是此试剂的性能受RPR 滴度以及前带现象和血清固定影响，所以试剂的推广应用还需要综合考虑梅毒在当地的流行情况以及监管和卫生政策制定[69-73]。

9 结语

本文从梅毒非特异性抗体来源、类型、生物学假阳性、血清固定、诊断筛查和治疗监测方面的传统认知和最新进展进行了详细综述，但梅毒非特异性抗体从基础到临床有太多的未知，深入研究梅毒非特异性抗体的来源、类型、生物学假阳性以及血清固定的发生机制，有利于理解梅毒疾病状态和非特异性抗体的关系、神经梅毒和隐性梅毒的发生这些难题，并帮助制定梅毒诊疗新策略。