m6A甲基转移酶复合物在肿瘤发生、发展中的作用研究进展

余梦霞 谢亚萍

到目前为止已有超过150种RNA的转录后修饰方式被发现，其中N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）是最常见的，最早于上世纪70年代被报道。随后在纯化出m6A特异性抗体的基础上，通过m6A测序、RNA免疫共沉淀等方法，科学家们证实其主要发生在mRNA的3'端非翻译区（3'untranslated regions,3'UTR）和终止密码子的特定 RRACH（R：G，A，U；H：U，A，C）序列上。近年来，大量文献报道m6A具有调节mRNA的功能，包括影响转录、调控剪切、调节出核、控制翻译。此外，m6A在非编码RNA，包括长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）、微小 RNA（microRNA,miRNA）、转运 RNA（transfer RNA,tRNA）、环状RNA（circular RNA,circRNA）、细胞内小核 RNA（small nuclear RNA，snRNA）等的剪切、加工、成熟过程中也具有重要调节作用。m6A修饰介导超过80% RNA的甲基化[1]，在各种生理或病理过程中发挥重要的作用。

正常生理状态下，m6A修饰通过甲基转移酶复合物和去甲基化酶在人体中保持着一种动态平衡状态，而当平衡被打破时就可能导致肿瘤的发生。到目前为止，科学家们认为m6A的甲基化是由甲基转移酶复合物协同完成，而其组成成员包括甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like-3,METTL3）、甲基转移酶样蛋白 14（methyltransferase like-14,METTL14）、甲基转移酶样蛋白 16（methyltransferase like-16,METTL16）、肾母细胞瘤1-结合蛋白（Wilms'tumor 1 associating protein,WTAP）、病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白（virlike m6A methyltransferase associated protein,VIRMA）、RNA结合基序蛋白15/15B（RNA binding motif protein 15/15B,RBM15/15B）和锌指CCCH域蛋白13（zinc finger CCCH domain-containing protein 13,ZC3H13）。近年来，越来越多的研究对这类成员的功能进行了探索，本文对m6A甲基转移酶复合物不同成员在肿瘤发生、发展中的作用相关研究进展作一综述。

1 METTL3在肿瘤中的作用

METTL3是第一个被识别的m6A甲基转移酶[1]，早在1997年就被发现，随后在不同物种中也相继鉴定出同源基因，具有多个别称，如IME4、Spo8或MT-A70，其结构非常保守，提示具有重要功能。人类METTL3基因位于14q11.2，共有10个外显子。现有的研究表明METTL3是m6A甲基转移酶复合物中重要成员，具有RNA甲基化酶活性，在正常生理活动中具有重要调节作用，而近些年的研究证实在肿瘤的发生、发展中，METTL3也具有重要调控功能。在胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）中敲低METTL3可降低去整合素和金属蛋白酶结构域的跨膜蛋白19（a disintegrin and metalloprotease domain 19,ADAM19）的m6A水平，增强其在胶质瘤干细胞（glioma stem-like cells,GSCs）中的表达，促进GSCs的增殖和自我更新，导致肿瘤的进展[2]，另一研究发现METTL3通过招募人类抗原R与m6A修饰的SOX2、POU3F2等癌基因的mRNA结合，增强其稳定性，促进GBM的进展[3]。在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）中，METTL3可被转录因子 CCAAT/增强子结合蛋白 ζ（CCAAT/enhancer binding protein zeta,CEBPZ）招募至m6A修饰的SP1的启动子区，促进SP1的翻译，激活原癌基因c-Myc，导致AML的发生、发展[4]。基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库资料，研究者发现高表达METTL3是肝癌患者预后不佳的危险因素，而后续研究证明过表达METTL3可使抑癌基因SOCS2 mRNA的m6A水平升高，被YTH结构域家族蛋白2（YTH domain-containing family protein 2,YTHDF2）识别，诱导降解，引起肝癌的发生、发展[5]。在乳腺癌（breast cancer,BC）中，癌基因HBXIP可通过抑制let-7g上调METTL3，而METTL3可反向促进HBXIP表达，从而形成一个正反馈环路，促进疾病进展[6]。肺癌中有研究发现β-榄香烯可靶向METTL3的S-腺苷甲硫氨酸结合域，抑制其RNA甲基化酶活性，降低m6A的水平，抑制自噬相关蛋白，如微管相关蛋白1轻链3 beta（microtubule associated protein 1 light chain 3 beta,LC3β）、自噬相关蛋白 5（autophagy-related protein 5,ATG5）和自噬相关蛋白7（ATG7），从而发挥抑癌功能[7]。Li等[8]发现前列腺癌（prostate cancer，PCa）患者中METTL3往往高表达，RNA甲基化免疫共沉淀测序（methylated RNA immunoprecipitation followed by highthroughput sequencing,MeRIP-seq）和转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）明确LHPP与NKX3-1是METTL3的靶基因，敲低METTL3可激活靶基因，抑制蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）通路活性，阻碍肿瘤进展。在口腔鳞癌中，Liu等[9]利用体内外实验证实METTL3可增强多梳家族环指蛋白4（polycomb group ring finger protein 4,PCGF 4）mRNA的m6A水平，招募胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（insulin-like growth factor 2 mrna-binding protein 1,IGF2BP1）稳定其 mRNA，促进癌细胞的增殖和转移。而在胃癌中过表达METTL3可增加pri-miR-17～92的m6A水平，促进DiGeorge综合征危象区基因8（DiGeorge syndrome critical region 8,DGCR8）与其结合，诱导剪切成熟，最终激活AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路，导致胃癌发生。定点突变实验表明pri-miR-17～92的m6A结合位点中A879最重要[10]。以上研究表明METTL3在肿瘤中具有重要的调控作用，是肿瘤精准治疗的潜在靶点。

2 METTL14在肿瘤中的作用

人类METTL14基因位于染色体4q26，共有12个外显子，与METTL3有43%相似的序列，是m6A甲基转移酶复合物重要的组件，两者在核斑上以1∶1的比例形成稳定的异二聚体，其中METTL14是RNA结合结构域。在肝癌中高表达METTL14是患者预后良好的因素，机制研究证实过表达METTL14后可促进m6A修饰的pri-miR-126与DGCR8的结合，导致其剪切成熟，继而抑制肝癌细胞的转移能力[11]。在GBM中，METTL14可增强ADAM19 m6A的水平，从而抑制GSCs的增殖和自我更新能力[2]。在BC中过表达METTL14可以抑制癌细胞的活性，而利用免疫荧光杂交和RNA pull-down实验证实lncRNA LNC942的+176～+265序列可与METTL14结合，增加下游靶基因CXCR4和CYP1B1的m6A水平并促进蛋白表达，导致BC进展，反向证明 METTL14的抑癌功能[12]。Ban等[13]发现METTL14可通过增加头颈鳞癌患者LNCAROD的m6A水平加强其稳定性，促进YBX1和HSPA1A的结合，避免YBX1蛋白被蛋白酶体降解，提高肿瘤细胞的增殖能力。在结肠癌中，Yang等[14]发现METTL14是低表达的，且与不良预后相关，通过RNA-seq和RNA免疫共沉淀发现METTL14可调控lncRNA XIST的m6A水平，促进YTHDF2与其结合并诱导降解，从而发挥抑癌作用。Gu等[15]在膀胱癌中发现METTL14可增加Notch1的m6A水平，降低其稳定性从而增强癌细胞的增殖和迁移能力。Weng等[16]研究发现METTL14在造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）中高表达，而在其向髓系分化过程中逐渐降低，沉默METTL14可通过抑制下游MYB和MYC两个靶基因的m6A修饰水平，促进HSC及白血病干细胞向髓系分化，从而抑制AML细胞的增殖。这些结果提示靶向METTL14可能是恶性肿瘤治疗的一个新方向。

3 METTL16在肿瘤中的作用

METTL16又称为METT10D，是一种新识别的m6A甲基转移酶，主要的作用包括调控腺苷蛋氨酸的水平和对snRNA进行甲基化[17]。Liu等[18]发现METTL16在结肠腺癌中高表达，而在直肠腺癌中无表达差异。然而，单因素分析发现高表达METTL16的直肠腺癌患者总体生存时间（overall survival,OS）显著延长。Yeon等[19]发现在结肠癌中METTL16存在移码突变，但对肿瘤的意义不明。目前有关METTL16的研究有限，需进行更多的探索明确其功能。

4 WTAP在肿瘤中的作用

WTAP又称为Mum2，其本身没RNA甲基化的功能，但可起协调作用，辅助METTL3和METTL14进行m6A修饰。早在2000年，WTAP作为肾母细胞瘤1基因（Wilms'tumor-1,WT1）的协作因子已被识别，随后WTAP被发现在AML中高表达，敲低WTAP后可显著抑制K562及HL60细胞株增殖，增强依托泊苷的细胞毒反应[20]。而Naren等[21]发现WTAP蛋白高表达，且与AML更短的OS相关。敲低WTAP可降低c-Myc的m6A水平，促进表达，但c-Myc是原癌基因，与结果矛盾，值得深入分析。Hu等[22]发现miR-550-1可抑制WTAP表达，降低WWTR1 m6A的水平，抑制Hippo通路，阻碍AML的进展。胰腺癌中，研究表明WTAP可稳定粘着斑激酶（focal adhesion kinase,Fak）mRNA，激活Fak/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）/Akt和 Fak/类固醇受体共激活剂 1（steroid receptor coactivator 1,Src1）/生长因子受体结合蛋白 2（growth factor receptor bound protein 2,GRB2）通路，增强癌细胞的迁移和侵袭能力。而Fak抑制剂GSK2256098可逆转WTAP诱导的促癌作用[23]。Han等[24]发现piRNA-30473是弥漫大B细胞淋巴瘤的癌性因子，其高表达预示不良OS，通过上调WTAP，增加m6A水平，piRNA-30473可促进HK2的表达，导致肿瘤发生、发展。lncRNA PCGEM1在肺癌中过表达，通过靶向miR-433-3p/WTAP可促进癌细胞增殖和迁移，过表达WTAP可部分逆转敲低PCGEM1的抑癌作用[25]。WTAP高表达是肝癌患者预后不良的独立危险因素。通过升高m6A，WTAP可抑制ETS1的表达，影响p21/p27的功能，发挥促癌作用[26]。Li等[27]发现高表达WTAP是胃癌患者预后不佳因素，其致癌作用和T细胞免疫反应相关基因的RNA高度甲基化相关。Tang等[28]发现在肾癌中WTAP高表达，且与更短的OS相关。体外敲低WTAP可促进ACHN和Caki-1细胞株的凋亡。机制研究表明WTAP可与CDK2的3'UTR结合，增强mRNA稳定性，而CDK2抑制剂（SU9516和K03861）可逆转WTAP的癌性功能。碳酸酐酶Ⅳ被认为是结肠癌中的抑癌因子，通过与WTAP结合可促进其泛素化降解，抑制Wnt通路的活性，阻碍肿瘤的进展[29]。因此，以上研究表明WTAP表达失调对于肿瘤的发生、发展具有重要意义。

5 VIRMA在肿瘤中的作用

VIRMA又被称为KIAA1429，在骨肉瘤中，研究发现其高表达，且与更短的OS相关[30]，而体外敲低KIAA1429后可抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。Lan等[31]在肝癌中发现KIAA1429高表达，且预示不良预后。沉默KIAA1429后可抑制癌细胞增殖和迁移能力，利用MeRIP-seq、RNA免疫共沉淀测序（RNA immunoprecipitation sequencing,RIP-seq）和 RNA-seq等方法，GATA3被证实为KIAA1429下游靶基因，通过增加m6A水平，引起RNA结合蛋白HuR分离，促进GATA3前体mRNA的降解。Qian等[32]发现BC中KIAA1429高表达，且与更短的OS相关。过表达KIAA1429可促进癌细胞的增殖和迁移。而RIP-seq方法确定其下游靶基因CDK1，KIAA1429通过非m6A修饰方法促进CDK1的表达，从而发挥促癌功能。在去势抵抗的PCa中，Barros-Silva等[33]发现VIRMA是高表达的。敲除VIRMA后可降低m6A修饰的水平，继而降低CCAT1和CCAT2的稳定性，发挥抑癌功能。现有的研究发现VIRMA在肿瘤中均起到致癌作用，但更多的研究需要被执行，进一步明确其功能。

6 RBM15/15B在肿瘤中的作用

RBM15又称为OTT或SPEN，而HUMAGCGB或OTT3是RBM15B的别称。Patil等[34]报道RBM15/15B在lncRNA XIST介导X染色体上基因的转录沉默过程中具有重要作用。通常XIST至少有78个N-甲基腺苷残基是呈高度甲基化状态，由RBM15/15B介导实现，当敲低RBM15/15B，可逆转XIST的甲基化状态，影响其基因沉默功能。后续的研究表明RBM15/15B在实体瘤中表达异常，可参与疾病预后风险模型的构建，然而，分子机制还未阐明，有待进一步研究明确其功能。

7 ZC3H13在肿瘤中的作用

ZC3H13又被称为KIAA0853或Xio。2018年Wen等[35]发现ZC3H13在细胞核内可调控m6A修饰，在小鼠胚胎干细胞中，当敲低ZC3H13后，WTAP/Virilizer/Hakai所形成的RNA甲基化催化复合物失去了核内定位功能，导致RNA甲基化失调，抑制干细胞自我更新，促进分化。而在果蝇体内，Knuckles等[36]研究发现ZC3H13与WTAP相互作用对m6A甲基化调控具有关键作用，并对果蝇的性别决定具有重要意义。而在肠癌中，Zhu等[37]发现ZC3H13是一个抑癌基因，通过抑制Snail、Cyclin D1和增加Occludin的表达，可激活Ras-ERK通路并抑制癌细胞的增殖和侵袭力。目前有关ZC3H13的研究还较少，其具体功能和作用机制未完全阐明，亟待将来的研究可以明确ZC3H13在肿瘤中的作用。

8 m6A甲基转移酶复合物调控肿瘤发生、发展的机制

基于目前已发表的文献，m6A甲基转移酶复合物调控基因表达的机制具体为：（1）增加pri-miRNAs的m6A水平，招募DGCR8，促进其剪切成熟，抑制靶基因的表达；（2）增加靶基因m6A水平，与YTHDF2结合，促进靶基因的降解；（3）增加靶基因 m6A水平，与YTHDF1结合，促进靶基因的翻译；（4）增加靶基因m6A水平，与IGF2BPs结合，增加靶基因的稳定性；（5）招募或诱导分离mRNA结合蛋白，影响mRNA的稳定性；（6）非依赖m6A方式结合靶基因的3'UTR，增强其稳定性；（7）干扰m6A甲基转移酶复合物的核内定位信号，影响其甲基化功能。m6A甲基转移酶复合物不同成员可通过上述机制调控下游癌性或抑癌性基因的表达，继而影响肿瘤的发生、发展。

9 小结与展望

近年来，随着气相-液相质谱、m6A测序、m6A单个核苷酸交联免疫沉淀等技术的出现，科学家们发现m6A修饰广泛存在于真核生物的RNA中并具有重要生物学功能，成为近十年来的研究热点。尽管已发现了m6A修饰过程中“读码器”“消码器”和“阅读器”相关基因，但仍有许多机制未被阐明，新的调控基因陆续被报道。所以，目前有关m6A相关蛋白及其功能的研究尚处于探索阶段。m6A甲基转移酶在肿瘤中表达紊乱，对肿瘤的发生、发展具有重要意义，本综述总结了已有研究中其对肿瘤的调控机制，但仍未完整。已有的研究发现部分m6A甲基转移酶在不同肿瘤中与药物治疗及放射性治疗敏感性、化学治疗耐药性密切相关，靶向m6A甲基转移酶相应基因可增强肿瘤细胞的放、化疗敏感性。虽然，目前只成功研发出了m6A去甲基化酶FTO的特异性小分子抑制剂，但m6A甲基转移酶的靶向治疗仍具有重大潜力。因此，在将来的研究中，进一步挖掘其作用机制对深入认识表观遗传学在恶性肿瘤中的功能、探索新的治疗靶点具有重要意义，将为临床精准治疗提供重要指导作用。