环状RNA在肿瘤免疫中的作用研究进展

项桐伟 李纪鹏 俞万钧

环状 RNA（circular RNAs,circRNAs）是一类单链闭环分子，缺少5'和3'末端以及多聚（A）尾巴，这使它们对核糖核酸酶R（ribonuclease R,RNase R）具有抗性并且比线性RNA更稳定[1]。circRNAs能够通过吸附miRNAs、与 RNA结合蛋白（RNA-binding proteins,RBPs）结合、参与蛋白质翻译调节等多种方式影响生理和病理过程[2-5]。circRNAs的异常表达与肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成、免疫逃逸等密切相关[6]。

人体的免疫系统通过免疫调节、监视和预防病原体的入侵来维持体内免疫稳定。由多种免疫细胞参与的免疫应答具有抗病毒、抗菌和抗肿瘤的功能。近年来的研究证明，非编码RNA尤其是circRNAs是调节免疫疾病和免疫应答新的关键分子[7]。因此，本文就circRNAs与免疫细胞、免疫相关分子以及circRNAs在肿瘤免疫中的作用研究作一综述。

1 circRNAs概述

1.1 circRNAs的生物学特性 circRNAs大小一般为100 bp至4 kb，最初被认为是异常RNA剪接的非功能性副产物。随着新一代测序和生物信息学技术的进步，越来越多的具有调控功能的circRNAs被发现。circRNAs按其来源一般分为外显子circRNAs、外显子-内含子circRNAs和内含子circRNAs 3类。大多数外显子circRNAs存在于细胞质中，而其他两个主要存在于细胞核中[7]。

circRNAs具有以下特性，使其成为疾病诊断和治疗的潜在标志物[8-10]。（1）高稳定性：circRNAs呈闭环结构，能耐受RNase R的消化，具有比线性RNA更高的稳定性。（2）高特异性：circRNAs表达具有组织特异性和疾病发展阶段的特异性。（3）高保守性：大多数circRNAs在不同物种间的序列是保守的。

1.2 circRNAs的生物学功能 目前报道的circRNAs的生物学功能主要为以下4个方面。（1）充当miRNAs海绵：circRNAs含有大量miRNA应答元件，circRNAs可以通过吸附miRNAs，解除其对靶基因的抑制作用，从转录后水平调控基因表达。（2）与RBPs相互作用：RBPs是类蛋白质，它们与circRNAs一起进行基因转录和翻译过程，并影响到circRNAs的加工、折叠和定位。（3）部分circRNAs可以和细胞核内的RNA聚合酶Ⅱ结合，在转录水平发挥作用[11]。（4）部分circRNAs可编码蛋白：circRNAs最初被认为没有蛋白质编码能力，但是研究人员发现拥有内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）的 circRNAs具有翻译的潜能[12]。如circ-ZNF609含了一个从起始位点到终止位点的开放阅读框架，可以在小鼠成肌细胞中与核糖体结合，通过IRES位点驱动蛋白质翻译[13]。

2 circRNAs在肿瘤免疫中的作用

先前的研究表明，肿瘤细胞、免疫细胞以及释放的细胞因子之间的“crosstalk”可能参与肿瘤免疫的调节，并建立促进肿瘤发展的环境[14]。近年来发现cir-cRNAs在调节机体对肿瘤的免疫力中有巨大的潜力。

2.1 circRNAs与免疫细胞

2.1.1 circRNAs与巨噬细胞 作为先天免疫的重要组成部分，巨噬细胞对宿主的内环境稳定起着至关重要的作用，可以根据不同的免疫状态改变宿主的表型和功能条件。哺乳动物巨噬细胞可以在不同的外部刺激下介导各种表型[15]。Zhang等[16]通过circRNAs芯片，对刺激极化的两种不同模式的巨噬细胞（M1和M2）激活进行差异表达谱分析，结果显示M1细胞中circRNA-003780、circRNA-010056 和 circRNA-010231高表达，而 M2细胞中 circRNA-003424、circRNA-013630、circRNA-001489和circRNA-018127高表达。该研究证实了circRNAs在不同极化状态的巨噬细胞中表达的差异，为circRNAs在巨噬细胞分化和极化中的作用提供了新思路。Chen等[17]证实circ-FARSA的高表达预示着M2细胞的比例更高，更有利于非小细胞肺癌（non small cell lung cancer,NSCLC）的恶性进展。Hu等[18]发现circ-ASAP1与肝癌根治性切除术后的肺转移有关，而circ-ASAP1能够通过调节miR-326/miR-532-5p-CSF-1途径介导肿瘤相关的巨噬细胞浸润。

2.1.2 circRNAs与T淋巴细胞 Wang等[19]发现circRNA-002178能够通过吸附miR-34增强程序性死亡分子配体-1（programmed death ligand-1,PD-L1）的表达，从而诱导T细胞衰竭。更重要的是circRNA-002178可以通过外泌体传递到CD8+T细胞，进而诱导程序性死亡蛋白1（programmed death 1,PD-1）表达。此外，Deng等[20]发现circ-LAMP1可以促进T细胞淋巴母细胞淋巴瘤的增殖，这种增殖效应可能是circ-LAMP1抑制了T淋巴细胞的凋亡。

2.1.3 circRNAs与自然杀伤细胞（natural killer cell,NK） NK细胞不同于T、B淋巴细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞。Ma等[21]发现circ-ARSP91可以增加肝癌细胞对NK细胞毒性的敏感性，提示circ-ARSP91可以通过增强NK细胞的细胞毒性来增强先天免疫监视能力。相反，circ-UHRF1的高水平表达可导致NK细胞比例减少和NK细胞肿瘤浸润减少，其机制为circ-UHRF1通过降解miR-449c-5p上调T细胞免疫球蛋白黏蛋白3的表达来抑制NK细胞功能[22]。

2.2 circRNAs与免疫相关分子

2.2.1 circRNAs与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF） VEGF在多种肿瘤中表达升高，已被认为是生理和病理性血管生成所必需的[23-24]。Zhong等[25]研究表明，circRNA肌球蛋白轻链激酶（circ-MYLK）可以通过吸附miR-29a减轻乳腺癌靶向血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）的抑制，从而促进肿瘤血管生成。此外，circ-SmarC5可与富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子1（serine and arginine rich splicing factor 1,SRSF1）结合，而SRSF1可以识别VEGF的近端剪接位点（PSS），并提高VEGFA的表达，从而促进肿瘤血管生成[26]。同样，Ji等[27]经体内和体外实验证实circ_001621通过miR-578/VEGF信号通路上调细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）和基质金属蛋白酶9的表达，促进了骨肉瘤的增殖和迁移。

2.2.2 circRNAs与IL IL在激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。Liu等[28]发现miR-495是circ_0000372的海绵分子，而IL-6是miR-495的靶基因。circ_0000372通过miR-495/IL-6激活JAK2/STAT3信号通路促进了结直肠癌的发展。Wang等[29]发现circ-RBM33和IL-6在胃癌组织和细胞系中表达升高，并与胃癌的临床病理特征密切相关，circ-RBM33通过吸附miR-149促进IL-6分泌，从而促进胃癌细胞的增殖和侵袭。

2.2.3 circRNAs与 IFN-γ IFN-γ由 T淋巴细胞分泌，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调控的作用。Yan等[30]发现IFN-γ可以诱导前列腺癌细胞发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），使用高通量测序分析IFN-γ对circRNAs表达的影响，结果显示，与未经过IFN-γ处理的细胞相比，IFN-γ处理组上调的circRNAs有827个，下调的circRNAs有1 279个。进一步研究发现其中的circ_0001165可通过hsamiR-187-3p/TNF通路，circ_0001085可通过 miR-196b-5p/PI3K-Akt通路间接参与IFN-γ诱导的前列腺癌细胞EMT。

2.3 circRNAs与肿瘤免疫治疗

2.3.1 PD-1/PD-L1 PD-1是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一种有288个氨基酸残基的膜蛋白。PD-1与其配体PD-L1的结合介导T细胞活化的共抑制信号，可以抑制T细胞的杀伤功能，对人体免疫应答起到负调节作用。因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对抗肿瘤有重要的意义[31]。Zhang等[32]在 NSCLC组织中发现circ-FGFR1的表达促进了NSCLC细胞增殖、侵袭和免疫逃避。其机制为circ-FGFR1能直接与miR-381-3p结合并作用于miR-381-3p的靶基因趋化因子受体4（C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4），促进了NSCLC的进展和对以抗PD-1为基础的肿瘤免疫治疗的耐药。Hong等[33]发现circ-CPA4和PD-L1在NSCLC中高表达，敲除circ-CPA4可以抑制细胞生长、迁移和EMT，并通过下调PD-L1来促进NSCLC细胞死亡。在肝癌中，染色体7q21-7q31的扩增与肝癌的复发和多药耐药性有关。Huang等[34]报道该染色体区域的扩增激活了circ-MET的表达，circ-MET通过Snail/DPP4/CXCL10轴诱导肝癌细胞免疫耐受。

2.3.2 细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4,CTLA-4） CTLA-4是位于活化的T细胞表面的一种跨膜蛋白。CTLA-4作用于免疫反应的启动阶段，其激活能够抑制T细胞免疫应答的启动，从而导致活化的T细胞减少并阻止记忆性T细胞的生成[35-36]。Zhao等[37]研究了竞争性内源性RNA网络在胰腺癌发生、发展中的作用，鉴定并验证了在胰腺癌组织中过度表达的5个关键基因，包括CXCR4、低氧诱导因子1A（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF1A）、E盒结合锌指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1）、多配体蛋白聚糖 1（syndecan 1,SDC1）和 Twist家族 bHLH转录因子 1（twist family bHLH transcription factor 1,TWIST1）。CXCR4、HIF1A、ZEB1和 SDC1在胰腺癌中的表达受 circ-UBAP2和hsa-miR-494调控。CXCR4和ZEB1的表达与CTLA-4和PD-1的表达均呈正相关。这提示circ-UBAP2介导了CTLA-4和PD-1的表达，进而调节免疫细胞的浸润和功能来调控胰腺癌进展。

2.3.3 胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（insulinlike growth factor 2 mRNA-binding proteins,IGF2BPs）IGF2BPs属于RNA结合的癌胚蛋白保守家族。以往的研究证实IGF2BPs在细胞极化、迁移、增殖和分化等多个方面发挥重要作用[38]。Li等[39]发现circNDUFB2充当支架，可增强三结构域蛋白25（tripartite motif containing 25,TRIM25）和IGF2BPs之间的相互作用，此TRIM25/circNDUFB2/IGF2BPs三元复合物通过调节蛋白泛素化和降解以及细胞免疫应答，参与了NSCLC进展过程中IGF2BPs的降解和抗肿瘤免疫的激活。

3 总结与展望

近年来，肿瘤免疫治疗尤其是免疫检查点抑制剂在抗肿瘤治疗中得到了成功的应用[40]。然而，仅有小部分患者从肿瘤免疫治疗中获益，肿瘤细胞的免疫耐受阻止了大多数患者从中受益。非编码RNA尤其是circRNAs引起了越来越多研究者的关注。circRNAs可通过多种机制参与免疫细胞功能的调节和免疫相关分子的表达，也能够通过作用于免疫检查点分子在肿瘤免疫逃逸中发挥作用。然而，对circRNAs在肿瘤免疫和治疗中发挥的具体生物学功能及其机制尚未明确。但高通量测序技术的成熟和更多免疫相关circRNAs的发现，将为肿瘤免疫治疗提供新的方向。