神经丝轻链在神经系统疾病中的研究进展

杨清燕，陈涓涓，吴 军

神经丝蛋白(neurofilaments，NF)是神经元细胞骨架的重要成分，作用为维持神经元正常形态及保持神经纤维的弹性，防止断裂，而神经丝轻链(neurofilament light，NFL)被认为是神经丝蛋白中最重要的一部分；实验研究表明，NFL作为轴突损伤的标志物对于不同神经系统疾病，包括肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)、亨廷顿舞蹈病(Huntington′s disease，HD)、急性缺血性卒中(acute ischemic stroke，AIS)等的诊断及用药疗效、预后评估等方面发挥着重要指导意义。本研究旨在对NFL的结构、功能、检测及其在不同神经系统疾病的相关研究进展做一综述。

1 神经丝蛋白和NFL的基本结构、功能概述

神经丝属于中间丝蛋白家族的第Ⅳ类型[1]，是一种介于肌动蛋白(6 nm)和肌球蛋白(15 nm)之间的圆柱形细丝，其直径约为10 nm[2]，是构成神经元轴突的特异性分子蛋白及神经元细胞骨架的重要成分。神经丝具有增加轴突结构稳定性，促进轴突径向生长，增加轴突的直径，提高轴突的脉冲传导速度等作用[3]；另外，神经丝主要定位在成熟神经元的胞体和突起中，负责轴浆运输，维持神经元正常形态及保持神经纤维的弹性，防止其断裂[3]。

典型的神经丝位于轴突中心，呈平行排列，由NFL、神经丝中链(neurofilament middle，NFM)、神经丝重链( neurofilament heavy，NFH)和α-内切蛋白(α-internexin，α-INT)组成[2]。所有亚基都具有保守的α-螺旋棒状结构域、可变的氨基末端和羧基末端区域，后者的长度赋予不同的分子量。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，将神经丝分为NFH(112.5 kDa)、NFM(102.5 kDa和145-160 kDa)、NFL(61.5kDa和70-86 kDa)与α-INT(55.4 kDa和58～66 kDa)[2]。神经丝的数量决定轴突直径，神经丝蛋白在表达前轴突直径较小，直到神经丝三组分(neurofilaments triplet proteins，NFTPs)大量表达后，轴突直径才增大；有研究显示，神经损伤后神经丝蛋白表达水平明显下降，轴突直径缩小，随着轴突的再生，神经丝蛋白表达逐渐恢复 ，轴突直径亦恢复正常[1]。由此可见，神经丝是轴突直径大小的主要决定因素。神经丝在神经元胞体合成后被运输至神经突起中，与微丝和微管共同组成神经细胞的骨架网络。在轴突的运输过程中神经丝发生磷酸化与去磷酸化，磷酸化的蛋白组装到轴突神经丝网络中，而原网络中的蛋白则去磷酸化后成为游离状态，新合成的神经丝蛋白不断与原神经丝网络中的蛋白发生新旧交换，以此进行自我更新[1，4-5]；NFL 是唯一可以自我组装的亚单位，其在体外可自我组装成70 nm 的纤维，而当 NFL缺如时，神经丝中链和神经丝重链都不能组装成功能性神经丝，因而 NFL被认为是最重要的神经纤维丝成分[3，6]。

神经轴索损伤是各种神经疾病中导致永久性残疾的病理基础，在神经系统疾病管理中，轴突损伤的识别和量化可以提高诊断的准确性，同时可作为预后评估标准[2，7]。神经丝蛋白是一种在大直径有髓轴突中高表达的神经元骨架蛋白，因此，炎症、神经退行性变、创伤性或脑血管病等疾病引起中枢神经系统轴突损伤时，神经丝蛋白将释放到细胞外液、脑脊液，并以较低浓度释放到外周血液中[8]，释放量的多少取决于轴突损伤的严重程度[7]。由于NFL是神经丝蛋白最丰富的亚基，也是可溶性的亚基，这使得NFL成为生物体液中最可靠的可测量的神经丝亚基[7]。近年来，NFL被作为神经轴索损伤的候选生物标志物，正受到越来越多的关注[2]。随着科技日新月异的发展，检测NFL的技术更加精准。临床研究发现NFL与各类疾病有密切的关联性，不管在疾病诊断、指导疾病预后、生物标记、疾病严重程度的预估、检测药物的有效性、预测预后等方面都有重要的指导意义。

2 NFL的检测方法

NFL作为轴索损伤的生物标记物，准确测量其浓度可协助了解多种疾病的发展过程，由于各种疾病状态导致的中枢神经系统轴突损伤，将NFL释放到细胞外液、脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和外周血液中，外周血液中的NFL均较细胞外液、脑脊液低[2]；在临床上脑脊液采样为创伤性检查，较外周血采样不容易获得；临床上更加希望能够用一种准确的测定方法来检测外周血的NFL以指导临床工作；既往的检测方法主要用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)技术测定脑脊液中的NFL浓度，由于血液中的NFL浓度仅为脑脊液含量的1/40[7]，ELISA测定血液NFL浓度的灵敏度不够[7]，难以达到要求。经过一系列的研究与验证，从第一代的半定量免疫测定法，再到第二代夹心ELISA法，再到第三代电化学发光(electrochemi luminescence，ECL)技术，已经大大提高了分析灵敏度。近年来，随着技术的发展，第四代单分子阵列(single molecular array，SiMoA)检测技术在定量NFL方面的灵敏度分别比ELISA和ECL分析法高126倍和25倍[2，9-10]，使得在疾病状态或生理条件下可以检测到NFL浓度范围，对血液中NFL水平进行可靠的定量测定，为科研和临床提供便利。SiMoA技术是采用经典的双抗夹心酶联免疫吸附测定法实现极低含量的蛋白定量检测，可实现单个分子的检测，检测灵敏度极高，通常在飞克(fg/mL)级别，比传统的ELISA方法灵敏度高1 000倍。

3 NFL与神经系统疾病相关

3.1 NFL与运动神经元病(MND) MND是常见的神经系统退行性疾病，其特征性病理改变为上下运动神经元均存在变性及退化，其中ALS是最常见的亚型。Weydt等[11]研究显示，ALS病人的脑脊液及血液中神经丝水平较正常人明显增高；尤其是 ALS的早期NFL水平升高更为明显，可能与病程早期神经元及轴突变性及退化速度更快相关。此外，NFL也可用于鉴别ALS与其他神经系统疾病及类MND疾病，其敏感性分别是88%和100%，特异性分别是92%和90%[12]。进展为ALS的下运动神经元病病人早期即存在血液及CSF中NFL水平增高，而Kennedy病及脊肌萎缩症病人该指标正常，提示NFL有望作为临床诊断标准之一，有利于缩短ALS确诊时间。治疗ALS的药物有限，疗效尽管不尽如人意，但仍有研究显示，NFL具有评估ALS治疗疗效的潜力，基线高水平的血清NFL病人死亡危险比为3.91[95%CI(1.98，7.94)，P<0.001][13]，提示NFL水平对于评估ALS预后具有提示作用。NFL水平越高，疾病进展越快，总体存活时间越短[14-16]；

3.2 NFL与多发性硬化(MS) 磁共振(MRI)是目前唯一可识别MS新病灶的技术手段，其对于白质病变成像效果较好，但对于灰质病变显示则欠佳，导致对MS灰质病变的低估，影响预后判断。神经轴索损伤是决定MS病人长期功能残疾最重要的决定性因素[17-20]，MRI不能准确检测出神经轴索损伤程度，而NFL是近年来用于评估神经轴索损伤的敏感标志物。目前认为可通过测量NFL浓度来间接反映轴索损伤程度，从而评估功能预后。Barro等[20]还提出NFL是一种实时、易于测量的神经轴突损伤标志物，比颅脑MRI更全面。有研究证实，脑脊液中NFL和血清NFL具有密切的相关性[21]；一项纳入259例MS病人的研究指出：MS病人NFL水平明显高于健康对照组[20-21]。Huss等[22]在近期一项为期24个月纳入34例复发缓解型MS(relapsing remitting MS，RRMS)病人的探索性随访观察研究中，分别使用醋酸格雷替拉默和β-干扰素治疗，通过观察复发事件(expanded disability status scale，EDSS)评分和MRI相关参数，发现病人急性期血清NFL水平高于缓解期 ，无复发病人的血清NFL水平从第9个月开始降低，提示除MAR外，血清NFL的纵向测量可用于监测MS活动性和治疗疗效。早在1998年，Rosengren等首次使用第二代免疫分析法测量脑脊液中的NFL水平，指出脑脊液中的NFL与MS病人的残疾程度(EDSS评分)、疾病活动程度及RRMS病人最后一次复发的时间具有相关性[23]，此后的数个大型临床试验中也将该结论不断得到重复和验证[20-21，24-28 ]。NFL还对疾病修饰治疗(disease modifying therapy，DMT)效果有指导意义，持续DMT病人的血清NFL浓度低于未经治疗病人，血清NFL水平高的病人未来复发和残疾恶化的风险比血清NFL水平低的病人高[29]。

3.3 NFL与创伤性脑损伤(TBI) TBI具有较高的致死率及致残率，早期确定损伤严重程度是调整治疗措施的关键。Smith 等[30]认为，神经轴索损伤是TBI预后的主要决定性因素。NFL被认为是可以量化神经轴索损伤的一种敏感标志物。多项研究表明，脑外伤后脑脊液和血液中NFL浓度明显升高；Shahim 等[31]研究证实，重型颅脑损伤后的前2周，脑脊液和血液中的NFL浓度与其他神经系统疾病或健康对照组相比急剧升高。研究显示，血液NFL水平与脑脊液中NFL水平呈线性相关，利用Simona技术可以检测血液内微量NFL水平升高，成为诊断轻微创伤性脑损伤(mild TBI，mTBI)的敏感指标[32]。另一项纳入182例TBI 病人的研究指出，血清NFL水平与预后有相关性[33]。血液NFL可以准确地识别颅脑外伤后头颅CT表现异常病人，有助于临床医生决定脑外伤病人是否需要接受头部CT或MRI检查[34]。目前的研究结果需要进一步研究来确定头部创伤后血液NFL的动态变化，从而确定其测量的最佳时机。

3.4 NFL与亨廷顿病 亨廷顿病是一种常染色体显性的神经退行性遗传病，由HTT基因上的CAG重复扩增导致突变型亨廷顿蛋白(mutant Huntingtin，mHTT)的异常沉积而致病，目前尚无有效治疗方法。识别及预测疾病进展和治疗效果的敏感生物标志物，可为深入研究亨廷顿病带来新的前景[35]。2017年一项纳入201例携带HTT 突变个体的回顾性研究分析显示：HTT突变携带者血浆中NFL浓度高于正常对照组[36]。另有研究证实，血浆中NFL浓度与HTT CAG重复计数之间的相关性；NfL浓度与壳核、尾状体、灰质和白质在MRI测量的体积呈负相关，与认知功能及总体功能、脑萎缩有相关性，表明NFL浓度随着亨廷顿病病人疾病严重程度的进展而增加[36-38]。另一项横断面研究指出，脑脊液和血清NFL可区分有临床表现的亨廷顿病和正常人、临床前期的亨廷顿病突变携带者，表明随着对NFL的进一步了解，早期、灵敏的检测NFL，可能有助于亨廷顿病疗法的开发和临床管理[35]。

3.5 NFL与AIS 缺血性脑卒中因神经元的丢失和反复发生的缺血事件导致严重残疾。预测组织损伤或脑卒中复发的生物标志物可能有助于指导个体化脑卒中治疗。近年来，研究发现NFL是缺血性脑卒中相关的潜在生物学标记物。一项大型前瞻性研究纳入504例AIS和111例短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack，TIA)病人发现，AIS病人血清NFL水平高于健康对照组[39]。此外，该研究还发现TIA病人血NFL水平低于AIS病人，表明NFL可以用来区分AIS和TIA病人[39]。2019年的一项研究指出，当血NFL浓度为4.9 pg/mL时，是鉴别AIS与TIA的最佳临界值(敏感度73%，特异度80%)。AIS病人入院时临床表现越严重，美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)评分越高，血NFL浓度越高[40-42]。不同卒中亚型血清NFL浓度也不同[43]，其中心脏栓塞或大动脉粥样硬化型AIS病人血清NFL浓度最高[42]。Tiedt等[44]还发现血清NFL在脑梗死后第7天时浓度达到高峰，也有研究提出NFL的最高浓度出现在缺血性脑卒中后第3周[29]，但因没有连续大样本量的线性研究，NFL最高浓度出现时间节点目前尚无统一定论。NFL还可以预测脑梗死长期神经功能结局[43]。脑卒中后3个月内功能转归不良的病人入院时血NFL浓度高于转归良好的病人[41]。2019年发表在Stroke上的Uphaus等[40]研究也支持这一观点。

4 结 语

NFL对于上述疾病虽然没有特异性的诊断价值，但随着血清NFL 检测灵敏度不断提高，其已经成为临床医师评估疾病轴索损伤严重程度的定量测量物质，临床应用潜力逐渐被发掘，其作为神经系统疾病诊断、预测疾病活动性、预测疾病进展、随访预后、指导用药和疾病监测等的生物标志物的证据日益增多。但真正可以应用于临床工作之前，还需要进行一系列大型实验研究来评估其有效性和实用性。NFL是未来临床和研究中最有前途的生物标志物之一，其潜在的应用和未来的发展方向仍需要进一步探讨。