伴骨髓增生异常相关改变的急性髓系白血病细胞遗传学及分子生物学研究进展

吴安 欧阳桂芳 牧启田

伴骨髓增生异常相关改变的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes,AML-MRC）是2008年WHO正式命名的一个急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）亚型，这类患者通常具有发病年龄大、合并严重贫血症状、CD14高表达、预后差等特征。随着DNA芯片、二代测序等技术在临床上的广泛应用，AML-MRC遗传学本质也被不断发现。本文就AML-MRC遗传学和分子生物学研究进展作一综述。

1 AML-MRC概念

2001年WHO将细胞遗传学与细胞形态学、细胞化学、免疫表型和临床信息结合到髓样肿瘤的诊断中，并引入“伴多谱系发育不良的AML”这一新的亚型，以骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）样表现为特征的AML病例归为此类型。2008年WHO正式将该病命名为AML-MRC，并定义为外周血或骨髓中具有至少20%的原始细胞并具备以下任何一种情况：（1）髓系中至少两系50%及以上的细胞存在病态造血；（2）伴有骨髓增生异常的形态学特征或有MDS或骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasms,MPN）病史；（3）存在MDS相关的细胞遗传学异常。2016年WHO将伴del（9q）、NPM1突变或双等位基因CEBPA突变的多系病态造血的AML排除在AML-MRC之外，由于伴有这些遗传学改变的AML具有不同的临床转归[1]。

2 AML-MRC的细胞遗传学特征

AML-MRC的细胞遗传学特征具有很大的异质性，主要包括平衡易位和非平衡易位，其中以非平衡易位为主。按照2008年WHO髓系肿瘤分类标准，AMLMRC染色体异常与MDS特异性染色体核型基本相符，反映其MDS特性。非平衡易位主要表现-7/7q-、-5/5q-、i(17q)/t(17p)、-13/13q-、11q-、12p-/t(12p)、9q-、idic(X)(q13)；而平衡易位主要表现 t(11;16)(q23;p13.3)、t(3;21)(q26.2;q22.1)、t(1;3)(p36.3;q21.1)、t(2;11)(p21;q23)、t(5;12)(q33;p12)、t(5;7)(q33;q11.2)、t(5;17)(q33;p13)、t(5;10)(q33;q21)、t(3;5)(q25;q34)[1]。此外，AML 伴有复杂核型（complex karyotype,CK；3个及以上无关染色体异常）也归为AML-MRC亚型。但需要排除伴重现性细胞学异常的 AML（acute myeloid leukemia with recurrent genetic abnormalities,AML-RGA），如 t(8;21)、t(15;17)、t(9;11)、inv(16)/t(16;16)等 AML 类型[2]。

2.1 -7/7q-、-5/5q-染色体异常 -5/5q-、-7/7q-是MDS最常见的染色体异常，其中-5/5q-占30%，-7/7q-占21%[3]。在AML中，单纯-5/5q-并不常见，约占10%；且大多合并其他染色体异常[如-7/17p异常、CK、单体核型（monosomal karyotype,MK）或 TP53基因突变]，因此总体生存率较差，即使异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,HSCT）也不能改善患者预后[4]。此外，在AML病例中，存在-7/7q-者往往预后不良[5]。

2.2 t(v;5q33)/t(3;5)染色体异常 2008年WHO将具有PDGFRA、PDGFRB或FGFR1突变并伴嗜酸性粒细胞增多的髓系肿瘤或淋巴系统肿瘤作为血液系统肿瘤的一个新的亚型。在AML-MRC中，t(v;5q33)主要涉及的5q33区域也发生PDGFRβ基因重排。目前，研究发现与5q33重排相关的髓系肿瘤染色体异常主要有t(5;12)、t(5;7)、t(5;17)和 t(5;10)，临床上均为罕见病例。Yabe等[6]在2 000多例血液肿瘤病例中筛选到9例t(v;5q33)染色体异常的AML，其中4例由MPN转化而来，同时发现5例新发AML与4例转化的AML患者在整个病程中均未出现嗜酸性粒细胞增高的现象；进一步研究发现，9例患者中有4例表现为单纯t(v;5q33)染色体异常，其余为CK，且绝大部分患者伴有FLT3、ABL1和RAS基因突变；而在骨髓细胞形态上，只有1例患者表现为至少两系50%以上的细胞存在病态造血。除了PDGFRβ基因重排外，Vardiman等[7]报道了1例t(5;11)染色体异常的AML-MRC患者，此易位形成的是NUP98-NSD1融合基因，该患者常规染色体核型为5q-，而荧光原位杂交证实为t(5;11)，即隐匿性染色体易位。

t(3;5)涉及染色体3q25.1和5q34位点，易形成NPM1-MLF1融合基因[8]。t(3;5)染色体异常多为单纯易位（约占72.5%），少数伴有附加染色体异常，最常见附加染色体为+8。这类型的AML-MRC患者多为FAB分型中的M2、M4和M6亚型，CD117、CD13和CD33表达阳性而CD34表达阴性；WT1基因突变多见，表达图谱与NPM1突变类似。临床上报道t(3;5)染色体异常的AML病例预后并不一致[9-11]。

2.3 t(v;11q23)染色体异常 在AML平衡易位中，除了5q33位点外，11q23位点也是较为多见的易位位点，涉及的该位点多形成MLL（KMT2A）基因重排。按照2008年WHO相关分类和定义，与AML-MRC相关的11q23易位只有 t(2;11)(p21;q23)、t(11;16)(q23;p13.3)。Fleischman等[12]总结了19例存在t(2;11)异常的患者，发现14例为MDS，而且很快进展为AML。目前为止，尚未鉴定出t(2;11)易位基因MLL的对手基因。据报道，t(11;16)易形成MLL/CBP融合基因，t(11;16)髓系肿瘤（包括治疗相关的MDS或AML）特殊之处在于，几乎所有病例接受过鬼臼素等拓扑异构酶Ⅱ抑制剂药物治疗，因此也可归为治疗相关髓系肿瘤亚型。研究表明，MLL/CBP融合基因多累及粒系和单核系成熟细胞，也会累及红系原始细胞，甚至部分患者可从AML转化成急性淋巴细胞白血病[13]。

2.4 MK/CK与AML-MRC的关系 MK定义为有2个常染色体单体或1个常染色体单体和1个结构异常并存，但需要排除 t(15;17)、t(8;21)、inv/t(16)等 AMLRGA[1]。2016年WHO髓系肿瘤分类中并未将MK定义为AML-MRC的特殊染色体异常，但近年来研究证实两者存在密切关系。Weinberg等[14]研究发现，在新发的AML患者中，约10%存在MK；而且这类患者发病年龄较大，骨髓原始细胞比例较低，CD34呈低表达，通常为伴有多系病态造血的AML-MRC。MK最常见染色体异常为-5/5q（占55%），其次为-7（占45%）。尽管MK-AML是临床治疗的棘手难题，但近年来研究结果也带来一些希望。Wierzbowska等[15]对年龄＞65岁的AML患者进行研究发现，与传统化疗比较，去甲基化药物地西他滨作为一线治疗药物能明显提高MK-AML患者的缓解率（27%比3%）和中位生存期（6.3个月比2.6个月），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。但对于高风险老年AML患者，去甲基化药物与传统化疗相比优势不大。

CK定义为一个细胞内有3个及以上无关染色体异常。在AML患者中，约10%～14%存在CK，且与TP53突变密切相关[2]。Devillier等[16]纳入了125例AML-MRC患者（包括CK-AML患者42例），研究结果显示AMLMRC患者易出现CK。但这类患者通常预后极差，HSCT是其长期生存获益的治疗方法之一，但仍具有较高的复发率[2]。研究发现，一种新型赖氨酸特异性脱甲基酶1抑制剂NCD38可以通过抑制造血调节因子的超级增强子来延缓白血病的发展进程，体内实验结果显示NCD38对伴CK的AML-MRC患者具有较好的疗效[17]，这为将来新药的开发提供了思路。

3 AML-MRC的分子生物学特征

3.1 基因突变类型 刘铭等[18]通过DNA测序分析了97例初诊MDS和AML-MRC患者，发现常见的15种基因突变包括：（1）RNA剪接因子基因U2AF1、SF3B1、SRSF2；（2）表观遗传调节基因 ASXL1、DNMT3A、IDH1、IDH2 和 TET2；（3）信号转导通路基因 JAK2、NRAS、KRAS和 PTPN11；（4）TP53、RUNX1 和 SETBP1。

AML-MRC不仅保留了MDS的细胞遗传学特征，也保留了其分子生物学特征。研究表明，MDS早期很少出现严格意义上与新发AML相关的基因改变，如NPM1、CEBPA突变和MLL重排。当MDS进展时，可出现 RUNX1、GATA2、CEBPA、FLT3 及 RAS 家族基因突变[19]。因此，AML-MRC患者基因突变数目明显多于MDS。此外，Yokoyama等[20]利用流式细胞分选技术检测发现，新发AML患者的基因突变（除DNMT3A、TET2和ASXL1外）主要集中在原始细胞群，而MDS和AML-MRC患者的基因突变可以出现在原始细胞群、成熟粒细胞群和T细胞群，提示MDS和AML-MRC起源于更早的多能干细胞或多能祖细胞，可帮助鉴别新发AML和AML-MRC。尽管AML-MRC涉及的突变基因较多，但AML-MRC仅与ASXL1和U2AF1突变明显相关，且该类型较易出现 TP53 突变[16，21]。

3.2 基因突变特点

3.2.1 ASXL1基因突变特点 ASXL1基因位于20q11染色体，编码一个长为1 541个氨基酸的核蛋白。ASXL1基因突变发生于多种髓系肿瘤，包括慢性粒单核细胞白血病（chronic myelomonocytic leukemia,CMML）、MDS、MPN和AML 等，通常与 EZH2、IDH1/2、RUNX1及TET等基因突变协同出现，多为移码突变和无义突变[22]。Devillier等[23]比较了细胞遗传学中危风险的36例AMLMRC患者和37例新发AML患者的ASXL1基因突变情况，结果发现AML-MRC组ASXL1基因突变的发生率远高于新发AML组（47%比0%，P＜0.01）；同时还发现ASXL1基因突变与RUNX1基因突变呈正相关，与DNMT3A、NPM1和FLT3基因突变呈负相关。该研究团队在另一篇报道中分析125例AML-MRC患者的ASXL1基因突变情况，结果发现伴有ASXL1基因突变的患者比野生型患者的粒系细胞发育异常率更高，并证明ASXL1基因突变是其预后不良的独立影响因素[16]。有研究在斑马鱼动物模型中用基因组编辑技术使单倍体的ASXL1基因发生突变，结果发现能诱导新生造血干细胞发生凋亡，如果同时敲除TET基因，能诱导AML的发生[24]。由此可见，ASXL1不仅参与髓系肿瘤的发生，也促进髓系肿瘤的进展。

ASXL1蛋白可与polycomb抑制复合物2（polycomb repressive complex2,PRC2）的核心蛋白EZH2结合，其突变常导致骨髓造血功能异常，加速肿瘤（如MDS、MPN、CMML、AML）的发生[25]。基于 ASXL1 基因在髓系肿瘤中的广泛突变以及在AML-MRC发生进程中起促进作用，开发针对ASXL1基因突变的药物具有重要意义。PRC2以EZH1/2作为催化亚基，研究表明口服选择性抑制剂UNC1999可同时抑制EZH2和EZH1赖氨酸甲基转移酶，在AML小鼠模型中显示出良好的治疗效果。此外，GSK126、GSK343、EPZ005687、EPZ-6438 等小分子抑制剂在小鼠模型中均显示出较好的EZH1/2活性抑制作用，因此研发针对EZH1/2基因突变的抑制剂有望成为新的AML-MRC靶向治疗药物[25]。

3.2.2 TP53基因突变特点 TP53是位于17p13.1的抑癌基因，TP53缺失或异常与17p异常有关[25]。在MDS中，TP53基因突变与5q-、高度CK和MK密切相关，是MDS预后风险最差指标之一[26]。在AML中，TP53基因突变发生率约为5%～10%，与化疗耐药和复发密切相关[27]。研究表明，将AML细胞株TP53基因敲除并不能促使染色体数目发生异常，但能诱发染色体结构异常[28]，这一结果与临床上观察到的TP53基因突变患者常常伴有CK的现象相符[21]。尽管未见文献报道TP53基因突变与AML-MRC存在密切关系，但在AML-MRC中TP53基因突变比例高达22%，明显高于新发AML[16]。AML-MRC患者整体预后不良，但如果伴有TP53基因突变，则预后更差。研究表明，MDM2负性调控TP53基因，因此MDM2抑制剂可促进TP53表达，进而诱导肿瘤细胞凋亡。目前，MDM2抑制剂单独或与其他化疗药物、BCL-2抑制剂或MEK抑制剂联合治疗难治性AML患者并取得良好的疗效。但MDM2抑制剂需要野生型TP53蛋白才能发挥其生物学功能，因此对TP53基因突变患者的疗效往往不佳。令人欣慰的是，目前已经研发出一种小分子化合物APR-246，它能重塑突变TP53的蛋白，恢复其正常生理功能[29]。一项Ⅰb/Ⅱ期临床试验研究采用APR-246和去甲基化药物序贯治疗伴有TP53的突变的MDS和AML患者，初步结果显示5例患者中有4例骨髓获得完全缓解，提示这类小分子化合物或许能为伴有TP53基因突变的AML-MRC患者带来希望。

3.2.3 U2AF1基因突变特点 U2AF1是一种U2辅助因子蛋白，可识别内含子3'端的AG剪接受体二核苷酸。U2AF1基因突变使许多基因包括剪切体和RNA识别基序（RRM）基因表达下调，导致RNA剪接的异常，影响靶蛋白翻译。U2AF1基因突变发生在5%～12%的MDS 中，最常见于 20q-和+8 核型[25，30]。

U2AF1基因突变与AML-MRC存在密切关系。吴凌云等[30]对349例MDS患者进行二代测序，结果发现30例存在U2AF1基因突变，其中U2AF1基因突变组白血病转化率明显高于未突变组，差异有统计学意义（40%比23%，P＜0.05）。Ohgami等[21]分析 93例 AML 患者[包括 AML-MRC 36 例、AML-未另行规定（not otherwise specified,NOS）31例、AML-RGA 17例、治疗相关的AML 9例]，结果发现AML-MRC患者基因突变频率最高，以NRAS、RUNX1、U2AF1和TP53基因突变较为常见；同时发现U2AF1基因突变与三系发育异常密切相关。Cho等[31]研究发现，U2AF1基因突变的AML-MRC患者WBC更低，发病年龄更小，+8染色体异常率更高。U2AF1基因突变患者往往预后较差。有文献报道伴有U2AF1及TP53基因突变的AML患者缓解率极低，总生存期和无病生存期均较差，是AML患者预后不良的独立影响因素[21]。因此，U2AF1基因突变情况能在一定程度上预测AML患者的临床预后。

3.3 共突变特点 在髓系肿瘤中，RNA剪切体基因突变常表现为相互排斥，但易与表观遗传学基因突变同时存在[18]。有文献报道MDS向AML转化过程中同时出现2个及以上的基因突变，而共突变基因的出现在MDS转化过程中起重要作用[32]。有研究对97例原发MDS和MDS转化而来的AML患者进行分析，结果显示23.71%携带2种及以上基因突变，不同突变的组合中以U2AF1和ASXL1共突变频率最高（占39.1%），其中MDS转化而来的AML 2例，MDS 7例；在7例MDS中，有5例最终发展为AML，提示U2AF1和ASXL1共突变的患者预后较差[18]。研究证实，TET2和SRSF2共突变可预测MDS向AML转化[33]。基于疾病的基因突变积累，AML-MRC患者具有3个及以上基因共突变的比例明显高于AML-NOS和伴复发性遗传学异常的AML[21]。共突变基因类型也存在选择性，Devillier等[16]研究发现，在AML-MRC中，ASXL1基因突变频率最高，主要见于非 CK（31%），可以与 RUNX1、DNMT3A、NPM1、FLT3-ITD等基因形成共突变；而TP53基因突变主要见于CK，很少与其他基因形成共突变。此外，研究证实共突变基因的数目越多，髓系肿瘤患者的预后越差[34]。由此可见，在髓系肿瘤中，共突变在一定程度上反映了疾病发生、发展的进程，同时也能预测疾病的预后。

4 小结

近年来，人们对AML-MRC的细胞遗传学特征有了基本认识，包括-5/5q-、-7/7q-、t(v;5q33)、t(3;5)、t(v;11q23)、CK、MK等。一些研究阐释了AML-MRC的分子生物学特征，如TP53、U2AF1及ASXL1基因突变可能提示预后较差。目前AML-MRC相关靶向治疗药物也进入临床前期研究阶段，为AML-MRC患者带来希望。但这些遗传学研究的发现只是AML-MRC发病机制研究的冰山一角，目前尚不了解染色体微缺失、微重复、微小RNA、表观遗传学、长链非编码RNA等遗传学改变与AML-MRC的关系，需要进一步深入研究来解决。