SARS-CoV-2 S蛋白及其受体血管紧张素转换酶2的研究进展

丁海麦 李彩艳 闫巧梅 张学明

2019年12月，新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）疫情在武汉暴发。新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）利用S蛋白S1亚基与人细胞血管紧张素转换酶2（HACE2）结合，通过宿主蛋白酶激活S2亚基，介导病毒进入宿主细胞，其传染性、致病性较非典型肺炎病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）更强，其中S蛋白在很大程度决定了该病毒的组织嗜性和致病性[1-2]。目前对SARSCoV-2的研究热点主要集中在S蛋白、血管紧张素转换酶2（ACE2）结构及S蛋白介导进入宿主细胞机制等，本研究对SARS-CoV-2 S蛋白及其受体ACE2的最新研究进展作一综述。

1 SARS-CoV-2

冠状病毒是一类具有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子形状不规则，直径约60～220 nm，外包膜有蘑菇状蛋白刺突；可分为Letovirinae和冠状病毒两个亚科，其中冠状病毒亚科又分为α-CoV、β-CoV、γ-CoV、δ-CoV等4个属，蝙蝠、鼠类、鸟类、家禽和家畜等都是冠状病毒宿主，其中蝙蝠是最主要的自然宿主，所携带的病毒约35%为冠状病毒。多数冠状病毒对人和动物具有致病性，α-CoV、β-CoV可引起人类和哺乳动物呼吸道、肠道及中枢神经系统感染，γ-CoV、δ-CoV主要感染禽类。目前可感染人类的冠状病毒仅有 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoVHKU1、SARS-CoV、MERS-CoV[3]和 SARS-CoV-2，其中SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2的致病性及传播力较强。

根据前3个测定的SARS-CoV-2基因组序列对其基因组注释，SARS-CoV-2基因组有14个ORF编码27种蛋白。基因组5'末端的orf1ab和orf1a基因分别编码pp1ab和pp1a蛋白，这两种蛋白包含15种非结构蛋白（nsp，具体为 nsp1～nsp10，nsp12～nsp16）；基因组3'端编码4种结构蛋白（刺突蛋白S、包膜蛋白E、基质蛋白M和核衣壳蛋白N）和8种辅助蛋白（3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b 和 orf14）。与数据库相关冠状病毒进行比较，氨基酸水平上SARS-CoV-2与SARSCoV非常相似，但有一些明显差异，如8a蛋白存在于SARS-CoV中，而SARS-CoV-2中则无；8b蛋白在SARSCoV中为84个氨基酸，而SARS-CoV-2中则为121个氨基酸；3b蛋白在SARS-CoV中为154个氨基酸，而在SARS-CoV-2中则只有22个氨基酸。基于全基因组的系统进化树表明，SARS-CoV-2与人CoV、MERSCoV、蝙蝠CoV、SARS样蝙蝠CoV和SARS-CoV处于同一β冠状病毒演支，SARS-CoV-2在整个基因组序列方面更接近SARS样蝙蝠CoV，基因组与SARS样蝙蝠CoV（MG772933）的基因组相似度最高，SARSCoV则由SARS样蝙蝠CoV进化而来，甚至SARSCoV-2与Bat-SL-CoVZC45的nsp7和E蛋白氨基酸序列完全相同，表明蝙蝠可能是SARS-CoV-2的宿主[4]。

2 ACE2

SARS-CoV-2细胞受体ACE2是羧肽酶ACE的同源物，羧肽酶生成血管紧张素Ⅱ，是肾素-血管紧张素系统（RAS）的主要活性肽。目前认为ACE2主要功能有负调节RAS、参与肠肾中性氨基酸吸收及SARSCoV-2与SARS-CoV进入细胞受体等。

2.1 RAS 在RAS中，ACE把肾素切割血管紧张素原产生的血管紧张素（Ang）Ⅰ再次切割成AngⅡ。AngⅡ是RAS的关键调节因子，可通过两个G蛋白偶联受体调节血管强效收缩、细胞生长、肥大细胞以及炎性细胞因子的分泌、导自由基的生成和氧化分解等生物学功能。

2000年发现了一种新的、与人类ACE相关的羧肽酶ACE2，该基因定位于X染色体p2段2，包含18个外显子。ACE2由805个氨基酸组成，分子量约为120 kD，包含N端肽酶结构域（PD）和C端Collectrin样结构域（CLD），CLD末尾有单个跨膜螺旋和一个含约40个残基的细胞内段。ACE2可以降解AngⅡ为Ang1-7；还可以直接水解AngⅠ，产生无活性的Ang1-9肽，然后通过ACE或其他肽酶转化为血管扩张肽Ang1-7；还可以对抗ACE与 AngⅡ，发挥舒张血管、抗组织纤维化、抗增殖和利尿等作用，对激活的RAS进行负调节[5]。此外，ACE2还可以通过ACE2/apelin信号发挥重要的心血管保护作用，参与细胞增殖、凋亡、分化、炎症反应、氧化应激反应及血压调控[6]。

2.2 ACE2及其同源物Collectrin转运中性氨基酸BoAT1（SLC6a19）是肾脏和小肠上皮细胞主要的中性氨基酸转运载体，BoAT1 mRNA在肾脏近端小管和小肠高表达，蛋白定位在小肠上皮细胞和肾脏近端小管上皮细胞刷状缘。研究发现，促进ACE2表达可提高肠黏膜中性氨基酸转运载体BoAT1的活性，从而增加中性氨基酸的转运；进一步研究发现，只有BoAT1存在时，仅能低效率地转运氨基酸，而与ACE2结合后，氨基酸转运效率可增加至原来的10倍，提示 ACE2与BoAT1相结合并不能改变BoAT1对氨基酸的选择性，但能极大地提高其对氨基酸的转运速率[7]。定位于肾脏近端小管的刷状缘ACE2的同源物Collectrin是一种非催化蛋白，它在肾近端小管中性氨基酸再吸收过程中起关键作用[8]。

2.3 S受体 SARS-CoV-2与SARS-CoV的S蛋白氨基酸同源高达80%，SARS-CoV的S多克隆抗体能有效中和SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞进入，说明两者的S蛋白结构相似，推测SARS-CoV-2同SARSCoV一样借助S蛋白与受体细胞ACE2结合进入细胞。BHK-21细胞系对SARS-CoV-2和SARS-CoV不敏感，正常情况下两种病毒无法有效侵染BHK-21，当BHK-21表达ACE2后，ARS-CoV-2同SARS-CoV一样能有效侵染BHK-21细胞[2]。

SARS-CoV-2与SARS-CoV受体都是ACE2，那么S蛋白如何结合ACE2？获得ACE2在细胞膜上的稳定存在状态有助于解决这一问题。ACE2为膜蛋白，很难在体外获得稳定结构。有研究借助肠道内ACE2与BoAT1能够形成稳定复合物，通过共表达获得ACE2与BoAT1稳定复合物，用冷冻电镜成功解析了ACE2-BoAT1三维结构，发现ACE2以二聚体形式存在，维持二聚体的作用力主要是两个ACE2单体颈部结构域氨基酸残基相互作用力，而PD之间的作用力很弱，这种弱作用力便于PD转位而呈现出“开放”和“关闭”两种构象[9]。无论是开放状态还是关闭状态，PD都能与S蛋白结合。因此，二聚体ACE2可同时容纳两个S蛋白三聚体，这种聚集作用有助于膜的内陷和病毒颗粒的内吞。ACE2的PD存在6个糖基化位点，其中Asn53、Asn90、Asn322三糖基化位在RBD结合位点附近，糖基化能使病毒逃过人体免疫细胞识别和攻击。氯喹能干扰ACE2的末端糖基化，减少病毒与受体细胞膜上ACE2的结合，纳入SARS-CoV-2治疗方案[10]。此外，ACE2的C末端（特别697-716）存在TMPRSS2蛋白酶切割位点，ACE2与S蛋白结合后，TMPRSS2蛋白切割ACE2，有助于S蛋白驱动的病毒进入[11]。

借助ACE2单细胞表达水平，评估SARS-CoV-2除呼吸系统外对其他主要器官的潜在损伤。SARSCoV-2最主要的靶点是肺Ⅱ型肺泡上皮细胞（AT2）和巨噬细胞，其次是心肌细胞和肾上腺基质细胞，最后是睾丸、卵巢和甲状腺的基质细胞。由于极化的肾近端小管细胞、肝胆管细胞和肠细胞ACE2定位在细胞的顶端区域，病毒不容易到达，不是SARS-CoV-2的主要靶器官。提示SARS-CoV-2患者除急性呼吸窘迫综合征外，治疗期间还应注意心血管系统、内分泌系统和生殖系统的潜在伤害[12]。

值得注意的是，当SARS-CoV S蛋白与ACE2结合后，导致ACE2水平下降，AngⅡ水平升高，RAS激活，进而导致免疫反应失衡，炎症风暴启动，迅速引起单器官或多器官功能衰竭，最终威胁生命。已有小鼠实验表明，ACE2能改善SARS－CoV、酸吸入和败血症等引起的急性肺损伤，重组人ACE2能改善SARS-CoV引起的急性肺损伤[13]。最近研究发现，一部分人感染SARS-CoV-2后或受刺激性细胞因子（如干扰素）的刺激，ACE2表达显著上升，加速SARS-CoV-2通过ACE2进入受体细胞，促进其复制和扩散[14]。关于干扰素治疗SARS-CoV-2的利弊如何，仍需进一步研究明确。

3 S蛋白

冠状病毒侵染受体细胞是一个复杂的过程，需要S蛋白与受体结合及宿主蛋白酶协同作用。S蛋白是位于病毒包膜表面呈刺突状的高度糖基化、同源三聚体Ⅰ膜融合蛋白。S蛋白是由S1亚基和S2亚基组成。S1亚基含受体结合域（RBD），是决定细胞嗜性、宿主范围和动物传播的关键部分。S2亚基含有疏水性融合环和2个七重复区域（HR1和HR2），具有卷曲螺旋结构，介导病毒包膜和细胞膜的融合。在S蛋白特定位点切割是侵染宿主细胞的前提，对于多数冠状病毒而言，在S蛋白S1和S2亚基之间的边界区及S2'存在蛋白酶切割位点。常见的蛋白酶有跨膜丝氨酸蛋白酶（TMPRSS2）、组织蛋白酶 B/L（CatB/L）及Furin等。与SARS-CoV相比，SARS-CoV-2 S蛋白S1和S2亚基之间的边界区多Furin位点，且两者S蛋白结构不同。

3.1 S蛋白S1和S2亚基边界Furin位点 比较SARS-CoV-2与SARS-CoV核苷酸序列发现，在SARS-CoV-2 S蛋白S1和S2亚基之间的边界处插入PRRA的4个氨基酸残基后，该位点可被Furin切割[15]。目前已测序的SARS-CoV-2分离株都存在Furin位点，而与其密切相关的RaTG13 S蛋白中却没有发现Furin位点。借Furin位点就可将SARS-CoV-2与SARS-CoV等冠状病毒区分开来。

同其他Furin病毒一样，SARS-CoV-2 S蛋白在生物合成过程中就被宿主高尔基体Furin在S1/S2边界区切割。因此，在S1和S2亚基膜融合前构象中以非共价结合。SARS-CoV-2病毒包装机制与埃博拉、HIV等一样，而不同于SARS-CoV。进一步说明 S1/S2边界Furin切割对SARS-CoV-2感染宿主细胞的影响，构建了缺少PRRA氨基酸残基的S蛋白突变体（Sfur/mut）假病毒（MLV），突变体假病毒出芽时S蛋白没有被切割，发现突变体假病毒侵染VeroE6细胞（不表达ACE2）效率高于野生型假病毒，而对转染hACE2的BHK细胞的侵染效率则相反[16]。说明Furin切割主要不是参与S蛋白介导膜融合，而同其他高致病性禽流感病毒及MERS-CoV一样，SARS-CoV-2 S蛋白包装前Furin切割，有助于RBD与ACE2结合及随后的TMPRSS2切割，扩大宿主趋向性及致病性。由于Furin几乎在所有类型细胞中都表达，相比SARS-CoV，SARS-CoV-2宿主更广，传染性及致病性更强。

3.2 S蛋白与ACE2结合 不同种类的冠状病毒借助S1亚基不同结构域来识别、附着受体。如人类冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-HKU1借助S1亚基结构域A结合宿主细胞表面的糖蛋白和糖脂上的5-N-乙酰基-9-O-乙酰基唾液酸苷感染易感细胞；MERS-CoV借助S蛋白N端结构域A先结合附着宿主细胞表面的唾液糖多和黏液蛋白，随后结构域B与受体二肽基肽酶 4（DPP4/CD26）结合；而 SARS-CoV-2及 SARSCoV则通过S1亚基RBD直接与ACE2相互作用而进入靶细胞。RBD位于S1亚基C端306-575区域，其中424-494为受体结合基序（RBM）直接介导与ACE2的相互作用。尽管SARS-CoV-2及SARS-CoV S1亚基RBD结构相似，但在RBD与ACE2作用界面上发现十几个氨基酸改变[17]。这些变化整体上增强了SARSCoV-2 RBD与ACE2之间的亲和力。

冠状病毒颗粒与受体细胞结合前，S蛋白通常以亚稳定的预融合状态存在。为了接合受体，S1的RBD经历铰链状构象运动，该构象运动不时隐藏或暴露RBD结合受体位点。这两个状态分别称为“向下”构象和“向上”构象，其中向下对应于受体不可及的状态，向上对应于受体可及的状态。SARS-CoV S蛋白的3个RBD均处于“向下”构象，紧紧地包住邻近的N末端结构域（NTD），无法结合ACE2。RBD通过铰链状构象运动从“向下”构象变为“向上”构象，该构象下RBD没有空间位阻顺利结合ACE2。而SARS-CoV-2处于“向下”构象的RBD的角度更靠近三聚体中心位置，其中3个RBD中的1个处于“向上”构象，与SARS-CoV相比SARS-CoV-2更容易与ACE2结合[18]。SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2结合时，ACE2与1个向上构象的RBD结合导致3个RBD都形成不稳定“向上”构象。RBD与受体结合后破坏了S蛋白亚稳定状态，导致S1亚基的脱落，S2'位点被宿主蛋白酶水解，S2亚基构象变化暴露出融合肽，随后融合肽插入宿主细胞膜并与之融合，将核酸分子释放进入胞内，完成侵染过程。

3.3 S蛋白介导SARS-CoV-2进入受体细胞 根据病毒和细胞类型不同，S蛋白与受体结合后，利用宿主TMPRRS2、CatB/L、Furin、胰蛋白酶等水解 S2 亚基暴露融合肽。这些蛋白酶在靶细胞上的有效性很大程度上决定了冠状病毒是通过细胞膜还是内吞进入细胞。冠状病毒S2亚基中存在两个重要的保守重复氨基酸序列，即HR1和HR2，共同形成6-HB螺旋结构。6-HB在病毒包膜与宿主膜融合过程中起主要作用。

TMPRRS2是一类定位于细胞膜上具有保守丝氨酸蛋白酶结构域的蛋白酶，C端蛋白酶结构域在胞外，N端位于胞内。现已表明TMPRRS2是SARS-CoV及其他冠状病毒细胞膜融合进入宿主细胞不可缺少的蛋白酶[19]。为了评估TMPRRS2对S蛋白驱动SARS-CoV-2侵染细胞的影响，用氯化铵提高细胞内环境PH抑制CatB/L活性，发现S蛋白驱动SARSCoV-2侵染293T细胞（不表达TMPRSS2）受到强烈抑制，而侵染Caco-2细胞（表达TMPRSS2）基本无影响。SARS-CoV-2同SARS-CoV一样，S蛋白与ACE2结合后借助宿主TMPRRS2切割S2'，激活融合蛋白活性，诱导受体依赖性合胞体的形成[20]。

比较SARS-CoV-2和SARS-CoV与细胞膜融合效率，将分别表达SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白的293T细胞与表达ACE2的293T细胞在合适的条件下共培养一段时间，结果发现如果S蛋白是SARSCoV-2的，就会出现合胞体；如果S蛋白是SARS-CoV的，就没有合胞体；没有S蛋白或者ACE2，也不会形成合胞体。与临床结果一致，SARS-CoV-2 S蛋白介导的膜融合能力要更强，进入细胞的效率更高。分析原因，比较两者S2亚基的HR1和HR2的氨基酸序列，发现两者的HR2的同源性是100%，HR1有8个氨基酸不同[21]。SARS-CoV-2 HR1中8个氨基酸替换增强了HR1和HR2结构域之间的相互作用，进一步稳定6-HB结构，导致病毒包膜和细胞膜融合能力增强。

有研究利用构建的SARS-CoV-2假病毒转染HEK293/hACE2细胞，分别用溶酶体抑制剂、氯化铵和bafilomycin A处理HEK293/hACE2细胞，评价不同内吞体宿主蛋白酶对病毒包膜与内吞体膜融合的影响，与对照组相比，20 mm NH4Cl和100 nm bafilomycin A处理HEK293/hACE2后，SARS-CoV-2假病毒侵染率减少98%以上[21]，这表明SARS-CoV-2假病毒主要通过受体依赖内吞进入HEK293/hACE2细胞。冠状病毒选择胞质膜还是内吞进入细胞，与相应蛋白酶在靶细胞上的有效性和靶细胞所处环境有关。

4 小结

SARS-CoV-2引发的疫情正在全球范围内暴发，确诊感染人数还在持续猛增中。SARS-CoV-2 S蛋白暴露于病毒表面并介导感染宿主细胞，S蛋白是感染后中和抗体的主要靶点，也是治疗和疫苗设计的焦点。针对S蛋白RBM区域设计抗体，直接阻断其与ACE2结合活性的效果更好，但RBM序列保守程度较低，针对RBM区域的交叉保护抗体可能更难获得。RBM基序以外更保守区域的抗体具有交叉保护中和活性，缺乏ACE2阻断活性，抗体可能不那么有效。目前以ACE2为靶点的老药新用及利用重组人类ACE2蛋白中和SARS-CoV-2阻止SARS-CoV-2进入受体细胞，为治疗和预防SARS-CoV-2感染提供了一种新方案。