慢性肾脏病肾阳虚证动物模型的研究与思考＊

郑鹏飞，张新雪，赵宗江

（北京中医药大学中医学院 北京 102488）

慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease，CKD）已成为21世纪人类健康所面对的重要挑战。研究资料显示，目前广泛接受由KDOQI9和KDIGO11定义的慢性肾脏疾病（CKD）评估标准，系统性地估计CKD（包括1-5期）的全球患病率为3%-18%；而发表在柳叶刀的最新研究表明，截止到2040年，慢性肾脏病将成为第五大影响人类寿命的疾病[1]。我国流行病学调查显示，20岁以上成年人CKD的患病率在10%左右。慢性肾脏病起病隐匿，一旦出现症状，病情已较为严重，病程难以逆转，预后不良。近年来，由于社会发展、生活方式变化等原因，慢性肾脏病患者人数逐步增加，给国家和家庭带来了沉重的负担。

肾阳虚是慢性肾脏病中的常见而且重要的中医证候，研究阐明慢性肾脏病中肾阳虚证的生物学基础对于研究肾阳虚证的本质和发展中西医结合治疗慢性肾脏病具有重要意义。慢性肾脏病肾阳虚证动物模型可以客观地、直观地和定量地反映肾阳虚型慢性肾脏病病程中的生物学变化，揭示相关病证本质，为基础研究和临床治疗提供科学依据。目前，国内慢性肾脏病肾阳虚证模型已经取得了一定成果，主要产生了化学药物造模和复合因素造模两类造模方法，并获得了较为稳定的动物模型。但这些成果散在于实验文献中，缺乏对于模型制备和评价的系统研究，本文对这些模型文献进行了汇总整理，从模型概述、模型制备、模型评价等方面进行分析与评价。分析了现有慢性肾脏病肾阳虚证造模方法存在的不足，并根据这些不足提出了进一步研究的思路与方法，以期构建标准化慢性肾脏病肾阳虚证动物模型。

1 慢性肾脏病肾阳虚证动物模型的研究现状

肾阳虚证动物模型是最早建立的中医证候动物模型，早在1963年，邝安堃等[2]就采用氢化可的松建立了首个肾阳虚证动物模型。而随着上海沈自尹院士等[3-9]开展的一系列针对肾虚证本质的研究，肾阳虚证的动物模型也随之发展起来，时至今日其造模方法众多，评价指标丰富且仍处于不断进步之中。慢性肾脏病肾阳虚证动物模型是针对性在动物体内复制肾阳虚型慢性肾病病理变化本质的模型，但模型发展却不尽如人意，造模方法有限，局限于特定的化学物质或手术方法，在模型评价上虽有一般状况、肾脏病理和血尿生化等指标但缺乏综合性和共识性的评价指标体系。我们采取文献管理软件与人工结合的方法，以限定“肾阳虚”、“慢性肾脏病∕慢性肾病”、“模型∕造模”，“CKD”等词语为关键词，在中国知网、万方、维普、PUBMED等平台对相关文献进行检索和筛选整理，在检索获得的横跨1996-2018年的701篇文献中，与肾阳虚型肾病或肾脏病理这一主题密切相关的文献仅有20篇，占文献总数的2.9%，且缺乏专门针对肾阳虚型慢性肾脏病的综述性文献。从客观上反映了目前本病证模型发展所面临的局限。

1.1 慢性肾脏病肾阳虚证动物模型的造模方法

目前文献报道的动物模型造模方法仅有四种，两种为使用单一药物造模，一种为使用复合药物造模，一种造模方法为药物配合手术进行。

1.1.1 化学药物造模

1.1.1.1 腺嘌呤

傅氏等[10]将腺嘌呤制成混悬液后以200 mg·kg-1剂量每日定时灌胃给药，给药时间从第1天到第12天每日给药，从第12天后隔日给药直到第24天造模结束。操氏等[11]以腺嘌呤250 mg·kg-1给大鼠灌胃一个月。刘氏[12]等则在每日上午以10 mg·kg-1·d-1定时灌胃，持续21天。宋氏等[13]以200 mg·kg-1·d-1为标准，大鼠10 mL·kg-1·d-1将腺嘌呤以蒸馏水配制为2%的溶液在每日上午进行灌胃，同样持续21天。此外，还有其他人应用腺嘌呤方法制备模型[14-16]。

1.1.1.2 阿霉素

赵氏[17]比较了单纯注射阿霉素、左肾3∕4切除或全切合并阿霉素注射造模的方法，认为单纯注射阿霉素更符合肾阳虚表现。

1.1.2 复合因素造模

1.1.2.1 不同药物组合造模

王氏等[18]采取先分别以4 mg·kg-1和3.5 mg·kg-1两次尾静脉注射阿霉素制备水肿模型再以每日定时肌注氢化可的松的方式建立大鼠肾阳虚水肿模型。叶氏等[19]对阿霉素肾病肾阳虚证模型进行评价，采用一次性尾静脉注射阿霉素5 mg·kg-1再定时臀部肌注氢化可的松25 mg·kg-1的方式制备模型。

1.1.2.2 药物手术组合造模

孙氏[20]等报道使用丙硫嘧啶配合5∕6肾切除制备慢性肾衰肾阳虚模型。

1.2 慢性肾脏病肾阳虚证动物模型的评价方法

通过文献整理可以发现，目前慢性肾脏病肾阳虚证动物模型较为缺乏针对性强的评价方法与检测指标，主要为参考肾阳虚证模型评价附加肾脏疾病特有的部分指标。上述造模方法主要是采取动物出现体重减轻、畏寒、蜷缩弓背、反应降低、毛发稀疏等符合肾阳虚表现的状态作为界定证候造模成功的标志[10,12-16]，部分作者采取的是证候表现复合特定生化指标作为界定[17-19]，个别作者采取的是形态学复合生化指标[11]或证候表现复合药物反证[20]的方式。

具体评价方法和指标主要有以下几方面：

1.2.1 症状体征

包括对大鼠的体重体态，皮毛色泽，精神状态，活动状况，饮食饮水，体温，排泄，耳廓∕口鼻∕肛周等进行观察，此外还有引入抓力等作为观察指标的研究[16]。

1.2.2 生化指标

主要由血液生化和尿液生化指标组成。血液主要有尿素氮，肌酐，尿酸，总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白与低密度脂蛋白，cAMP∕cGMP[17-18]等，此外还有靶腺轴指标如下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴的甲状腺T3∕T4、下丘脑-垂体-性腺（HPGA）轴的雌二醇和睾酮[18]以及下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴指标ACTH、CORT和17-OHCS[16]，水通道蛋白AQP1，2[12,16]。尿液指标主要是尿液生化分析和24h尿蛋白定量。

1.2.3 肾脏病理

主要有以下几方面，肾脏大体形态观察：肾脏外观，肾脏色泽，肾脏包膜，肾脏皮质髓质交界与色泽。肾脏光镜观察，主要观察肾小球与肾小管结构与肾间质结构，包括肾小体数量，肾小球萎缩情况，肾小管扩张情况，上皮细胞病变，纤维组织增生与炎性细胞浸润等。肾脏电镜观察，包括对肾小球肾小管的结构和上皮细胞细胞器的观察[10]。

1.3 慢性肾脏病肾阳虚证动物模型的应用

目前，慢性肾脏病肾阳虚证动物模型主要有两方面应用：首先是病证结合模型研究，即西医的辨病与中医的辨证相结合。研究肾脏疾病与中医证型肾阳虚证的病理表现与模型研制。其次是研究中药与中药复方对于肾阳虚型慢性肾脏病的干预作用，如研究真武汤、右归饮对于肾阳虚型慢性肾衰的干预作用。两者紧密联系，前者为后者提供了模型试验基础，后者的成功运用则反过来推进了相关模型评价指标等方面的发展。当然肾阳虚肾脏病动物模型有待于进一步拓展应用范围，挖掘应用深度，并与其他领域相结合，体现其学术价值。

1.4 慢性肾脏病肾阳虚证动物模型存在的问题

目前，通过现有的文献整理表明：慢性肾脏病肾阳虚证动物模型存在以下问题：（1）构建方法少（药物灌胃或注射、手术），具体造模方式主要采用病理造模方法如药物注射方式，个别采取药物配合肾切除的复合造模，而造模药物也局限于腺嘌呤、阿霉素与氢化可的松三种药物，且应用已经达到达二十年左右，难以见到其他药物的使用；（2）模型评价方式较为简单，主流是直观反映中医证型的一般状况与反映病理机制的生化组织学相结合，这种评价体系已经有多年历史，虽然能在一定程度上起到病证结合、反映疾病的病理机制的作用，但存在创新性不足，而且评价指标较为简单，比如认为动物出现一定症状表现即认为造模成功，而这种评价方式容易受到主观因素的干扰而损害可靠性，因此整体评价体系有待充实；（3）对于证候本质的深入研究不足，与肾阳虚证候有关的特异性标志物检测引入少，多为临床常见生化指标，分子生物学层面特别是组学研究参与不足；（4）与病理造模方法对应的中医病因造模方法更是未见到文献报道，中医证候因素参与明显不足。随着医学研究的不断深入，对于动物模型能够复刻人类疾病的还原程度以及对于中医证候本质认识的要求也不断提高，而滞后的造模方法严重阻碍了对疾病本质的研究探索。

2 标准化慢性肾脏病肾阳虚证动物模型的构建与评价

2.1 对慢性肾脏病肾阳虚证动物模型构建的思考

2.1.1 动物模型的构建

慢性肾脏病肾阳虚证动物模型，顾名思义，除了“慢性肾脏病”之外还有“肾阳虚证”，即中医证候表现。作为病证结合模型，在目前的模型构建中，主要着眼于现代医学的病理表现，而对于引入中医证候因素则存在不足。单纯的采用以药物模拟肾阳虚证表现，虽然可以再现阳虚证候，但实际上中医证候发展是一个多变而复杂的过程，单纯采用药物模拟可能并不能完全真实反映中医证候的发生发展,难以将“病”与“证”有机结合，采用复合因素，尽可能还原真实疾病情况与模拟病因病机制备模型可能是更加理想的选择。在造模方式上，可以考虑参考肾阳虚证本证的造模方式，不单独使用药物从现代医学肾损害的角度来造模，还要从中医病因病机上入手，加入能体现中医思想并能在一定程度上量化的方式对肾阳虚证的病因病机进行模拟，从而达到还原真实疾病发生发展的目的。

2.1.2 作者团队的探索

在本团队的实际研究中，采取基础疾病合并复合因素的造模思路。即首先采用阿霉素尾静脉注射方式制备慢性肾脏病模型，阿霉素肾病模型其原理是阿霉素损害肾脏足细胞，肾小球出现节段性硬化，肾小管变形，呈现大量蛋白尿，在疾病表现上较为接近人类肾病综合征，随着阿霉素肾病的发展，大量蛋白的丢失，模型本身即有可能出现肾阳虚证的表现，随后采取增加复合因素二次造模的方式，复合因素参考肾阳虚证模型制备方法，如引入氢化可的松、羟基脲、他巴唑等药物方式，在保持模型动物器官完整的情况下利用药物诱导动物出现肾阳虚证的表现，最后筛选获得最符合要求的慢性肾脏病肾阳虚证动物模型。这种造模方式优点在于：首先，不通过手术造模，保持实验动物组织与器官完整，符合临床大多数患者双肾保存的实际，也可以规避手术对动物造成的不必要损伤与死亡；其次，采取阿霉素肾病作为基础慢性肾脏病模型，可以较好地模拟人类慢性肾脏病疾病表现，并随病程发展逐渐出现肾阳虚的症状；再者引入其他肾阳虚证造模药物，可以提高模型成功率，并且这些药物作用的靶器官表现可以一定程度上模拟慢性肾脏病后期机体多器官多系统受累的表现，从而再现阳虚证的多种证候表现；最后，通过这种多复合因素并行比较的方式，可以从现有的多种造模方式中筛选出最符合人类慢性肾脏病肾阳虚证表现的造模因素，进而建立标准化动物模型制备标准。而对于模型的评价，采取中医证候评分量表、临床生化指标检测、特异性靶腺轴标志物检测与组学指标检测，以及中药方剂反证方式相结合的评价体系，从而尽可能的全面准确把握慢性肾脏病肾阳虚证的证候与其本质。

2.2 对慢性肾脏病肾阳虚证模型评价方式的思考

2.2.1 评价指标

2.2.1.1 特异性指标的充实

在上文实验指标部分中，症状体征，靶腺轴指标和代谢指标cAMP∕cGMP属于常用的肾阳虚证的特异性指标，而其他指标大部分是CKD常规病理指标。有文献显示，慢性肾脏病标证以湿热、瘀血为主，本虚证包括脾肾气虚、肺肾气虚、脾肾阳虚证等[21-22]。而对这些证型的认定，目前根据文献总结来看仍以临床证候为主，对于中医证型对应生化指标研究仍以常规临床检验指标为主，如上海龙华医院对中医证型与实验室指标关系进行了研究，研究采用的指标均为临床常用指标[23]。而要完善模型的评价方式，确定模型证候是否符合造模要求，只有临床常规指标尚不能满足，需要在评价指标中增加靶腺轴等特异性指标的项目比重，从多个特异性位点进行评价，这样才能全面准确地评价模型。

2.2.1.2 新指标的引入

在新指标的引入上，目前在肾阳虚模型中已经广泛引入代谢组学等研究方法，并发现在肾阳虚证中在能量代谢、氨基酸和脂肪酸代谢上存在变化。比如关氏等[24]运用液质联用技术对CKDⅠ-Ⅴ期分期患者和健康人血浆代谢物进行分析，发现不同阶段CKD患者血浆标本存在明显差异,在血浆中找到鞘氨醇、牛磺酸、原卟啉Ⅸ等27个差异化合物。认为不同阶段CKD患者血浆中胆红素循环、鞘脂类代谢、类固醇类代谢等通路出现紊乱。李氏等[25]进行慢性肾衰竭早中期慢性肾衰竭患者血清代谢分析，发现与健康人血清相比较，精氨酸、脯氨酸、乙酸、谷氨酸、三甲胺、丙三醇、苯丙氨酸、乳酸等含量明显上升；柠檬酸、丙三醇磷酰胆碱、甘氨酸、α-葡萄糖、三甲铵乙内酯含量明显下降。林氏[26]等用血清蛋白质组学对糖尿病慢性肾脏疾病致病因子和早期诊断指标进行探索发现：MASP2、前凝血酶原、Igα1链C区段等与CKD的发生发展有关，由此认为临床血清蛋白质组学可作为CKD诊断有效研究手段。谢氏[27]对CKD4期不同证候及证候演变过程中脂质代谢物异常分析后得出结论：脾肾气虚兼湿浊瘀阻证、脾肾气虚、湿浊瘀阻兼湿热证的发展伴随eGFR降低，两组证候潜在脂质标志物主要是溶血性磷脂、磷脂和鞘脂。这些代谢组学结果可以反映机体内实时的代谢变化，与证候的发生发展具有同步性。但这些组学研究在慢性肾脏病肾阳虚证模型评价中却未见到相关报道。一些随着现代研究不断深入被挖掘的新指标新位点也极少体现在现行模型评价体系中，阻滞了对中医证型下疾病机制的揭示，这是发展肾阳虚肾病模型迫切需要解决的问题。

2.2.2 评价体系

2.2.2.1 整体评价体系的构建

在肾病模型的评价方式这一问题上，首先应对现有评价体系进行回顾，筛选针对性强的评价方式，在证候上选择表现明显，区分度好，有量化可能，并符合临床表现的证候。在生化指标上，增加特异性生化指标内容，特别是已经在实验中获得证实的靶腺轴指标应该作为常规评价方式。然后要建立非单一评价方式，对模型成模与否进行全面综合的评价。应注意考虑引入肾阳虚证的相关分子生物学评价指标，特别是代谢组学、蛋白组学、基因组学这三大组学，这些组学研究极大地推动了对于疾病证候的物质基础的认识，因此作为揭示疾病物质基础的重要手段，组学研究在慢性肾脏病肾阳虚证模型的评价体系中应是重要的组成部分。再有不可忽视从中医理论出发，根据肾的生理病理特点以及脏腑关系思考引入肾系以外的脏腑体系评价。最后，还应加入药物反证的内容。观察模型动物对证候对应方药的反应是验证模型是否符合所研究证候的重要方式。

2.2.2.2 肾外藏象评价体系

无论是慢性肾脏病还是肾阳虚证，都是全身综合性的病证，波及全身除肾外的多个脏腑器官。因此有必要考虑引入肾系之外的藏象评价。举例来说，肾具有主藏精、主水、主纳气的生理功能，肾阳可以推动和激发脏腑的各种机能，温煦全身脏腑形体官窍，推动和调控机体新陈代谢的过程，肾阳虚衰则脏腑机能减退。临床上与肾阳衰退有关的脏腑兼证常可见心肾阳虚和脾肾阳虚，表现除了肾系病症之外的心系和脾系症状，如心悸、胸闷、畏寒、腹泻等。而肾阳虚衰气化不利，则肾气衰弱摄纳无力，呼多吸少，表现出肺系症状。这些肾外脏腑的病理表现乃至病理生化指标也可以考虑作为参考，但也要把握证型之间的分界。当然，肾外藏象体系的评价还需要更多的临床与实验数据来支持。总而言之，打开思路，扩大视野，深挖内涵才能建立全面可靠的模型评价体系。

3 总结与展望

慢性肾脏病肾阳虚证模型对于揭示肾脏疾病与“肾阳虚证”的物质基础，探索治疗手段有着重要意义。但从文献来看，慢性肾脏病肾阳虚证模型一直以来缺乏系统的分析与研究。本文首次对慢性肾脏病肾阳虚证模型的文献进行了整理，总结了目前本模型的造模方法、评价指标与应用意义。同时也提出了目前模型存在的问题，讨论了可能的改进空间。当前模型发展的主要问题有：模型缺乏规范化；造模因素单一；模型成模缺乏公认可靠的判断标准；科学量化的生化与分子生物学指标体系不足等。在本团队的研究工作中，采用反复论证后确定的复合因素进行造模的动物已经表现出一系列阳虚证候，并为此制作了专门的分级量表进行量化处理，同时取材收集了动物的血清和多种靶器官组织进行了一系列靶腺轴与代谢物生化指标检测，后续还将开展三大组学的研究。因此，这一领域后续的研究，应该包括合理选择造模动物，规范和创新性造模方式，应用复合因素造模以及建立全面深入的动物模型评价体系，从而建立符合中医理论与临床实际的动物模型，这也是对于中医证候研究的重要补充和促进。