基于泛素—蛋白酶体途径探讨当归芍药散“肝脾同调-血水同治”治疗阿尔茨海默病的作用机制＊

陈云慧，张天娥，龚圆渊，夏 军，淮文英，谢璐霜，Yan Li，岳 雯

（1.成都中医药大学基础医学院 成都 611137；2.路易斯维尔大学医学院 路易斯维尔 40202；3.海南医学院中医学院 海口 571199）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种起病隐匿并呈进行性发展的神经系统退行性疾病，严重影响患者生活质量，给社会和家庭带来沉重负担。随着人口老龄化不断加剧，预计2050年全球AD患者人数将从当前的4 700万增加至1.315亿[1]。AD患者临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍，属于中医“好忘、喜忘、呆、呆痴、愚痴、健忘”等病范畴。中医理论认为肝郁脾虚、痰瘀阻窍是本病发生发展的关键因素，正所谓“呆病之成必有其因，大均其始也，起于肝气之郁、脾气之衰；其终也，在于痰瘀阻窍之患。”肝气郁滞，脾胃运化无权，水津输布、气血运行失常，血瘀津阻，痰瘀互结，痰阻血难行，血瘀痰难化，故痰瘀常互结，胶固而为毒，乃至脑髓失充，神机失用，发为呆病。

经方当归芍药散出自《金匮要略·妊娠病脉证并治第二十篇》和《金匮要略·妇人杂病脉证并治第二十二篇》，又被称为Toki-shakuyaku-san（TJ-23，日本）和Dangguijakyak-san（DJS，韩国）。原书记载“妇人怀妊，腹中㽲痛，当归芍药散主之”、“妇人腹中诸疾痛，当归芍药散主之。”原为疗妇人之疾而设，功善肝脾同调、血水同治。自20世纪80年代末日本学者首次采用当归芍药散治疗AD获效后，被广泛用于临床，并取得满意疗效[2]，再次彰显了经方的应用价值。然而，该方作用机制尚不明确。近年来，研究证实泛素-蛋白酶体途径（Ubiquitin proteasome pathway，UPP）——这一目前所知的最精细蛋白质降解途径在AD发生发展进程中扮演了重要角色，为科学阐释当归芍药散治疗AD的机制提供了新思路。本文拟在总结当归芍药散“肝脾同调-血水同治”治疗AD的临床疗效及其作用机制研究基础上，从UPP视角提出当归芍药散治疗AD的分子机制新假说，以期“古为今用”，秉承古方为现代临床治疗服务；“今为古用”，进一步开展相关实验研究积极阐释古方的科学内涵。

1 当归芍药散“肝脾同调-血水同治”治疗AD，临床疗效确切

日本学者牧田宪氏认为治疗AD首选当归芍药散。水岛宣昭等[3]首次报道AD患者经当归芍药散治疗后运动机能和智力水平均显著改善，在识别场地、时间、方位及远期记忆方面改善率为30.6%、有效率为73.8%。此后，当归芍药散被广泛用于治疗AD。山本孝之等[4]对该方治疗AD的疗效进行了临床比较研究，发现治疗组患者在日常生活中的会话、穿脱衣和短期记忆方面等方面均有显著改善。十束支郎等[5]对42例AD或脑血管性痴呆症患者连续给予当归芍药散8周，患者长谷川痴呆评分标准（HDS-R）评分及精神症状均得到改善，有效性71%。张士凡等[6]采用当归芍药散加味治疗老年痴呆21例，据1990年全国老年痴呆专题学术研讨会修订的疗效评定标准（讨论稿）评定治疗结果：痊愈11例、有效6例、无效4例，总有效率81%。韩祖成等[7]采用当归芍药散加减治疗AD 36例，配合语言、计算、书写等脑功能训练，参照1990年中华全国中医学会老年医学会试行标准评定：痊愈5例、显效6例、有效12例、无效13例，总有效率63.8%。高德义等[8]报道AD患者服用当归芍药散半年后，日常生活能力量表（AIM）和简易智力状态检查（MMSE）测定显示其智力和生活能力均有明显改善，患者血液超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化脂质酶显著增高。叶玉红[9]将80例AD患者随机分为对照组和观察组，给予对照组口服维生素E，每天2次，每次1片；观察组口服当归芍药散，每日1剂、分两次煎煮、温服，3个月为1个疗程，治疗2个疗程后，采用AIM和MMSE测定两组患者的生活能力及智力，结果表明当归芍药散能有效提高AD患者的生活能力及智力。经电子检索CBMdisc（1979-2010年）、CNKI（1979-2010年）、VIP（1989-2010年）和万方（1998-2010年）等数据库，辅以手工检索、收集中医药治疗AD的相关临床研究论文，共筛选出疗效确切且处方完整的论文175篇，涉及古方37首，而当归芍药散位列第四[10]，提示该方为临床治疗AD的有效方剂。

2 当归芍药散“肝脾同调-血水同治”治疗AD的作用机制研究现状

AD的发病机制十分复杂，目前尚未明确，存在细胞外Aβ沉积、Tau蛋白过度磷酸化、氧化应激、APP基因突变、自由基损伤、脂代谢紊乱、炎症、基因突变、胆碱能损伤、线粒体缺陷、感染等多种假说[11-13]。当归芍药散是治疗AD的有效药物，具有抗炎、抗氧化、神经保护、神经营养、调节神经递质、调控中枢神经系统及淀粉样蛋白前体蛋白等活性[14-15]。关于该方治疗AD的作用机制，学者们开展了大量研究。早在1989年日本学者研究即证实当归芍药散能增加痴呆小鼠乙酰胆碱酯酶（Acetylcholin esterase，AChE）阳性纤维密度，改善空间记忆能力[16]。随后，数项研究亦发现其可改善东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠的跳台逃避潜伏期、改善脑部微循环、有利于清除自由基[17]；改善小鼠中枢胆碱能神经系统功能障碍和SCOP诱导的AChE水平降低[18]；增加衰老小鼠大脑去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）、多巴胺（Dopamine，DA）和5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的含量，保护皮质超微结构损伤，促进纹状体NE和DA的表达[19-20]。

2000年后关于当归芍药散的作用机制获得更多学者关注，就AD发生发展的多个途径从细胞及动物模型入手开展了系统研究。结果表明当归芍药散能调节单胺类神经递质及其代谢、保护衰老导致的皮质超微结构损伤，改善秋水仙碱诱导AD模型的学习获得障碍，并提高SOD水平[21]；促进神经生长因子合成并防止多巴胺二羟基苯乙酸及DA代谢产物高香草酸的减少，促进神经生长因子NGF的合成[22]；促进转化生长因子β的表达[23]；明显提高AD大鼠海马中多巴胺（Dopamine，DA）和肾上腺素含量，提示其学习记忆能力的提高与减少单胺类递质密切相关[2]；改善东莨菪碱对大鼠空间参考记忆和空间工作记忆的损伤[24]；抑制Aβ25-35诱导的神经元损伤和乳酸脱氢酶，显著降低Aβ25-35诱导的神经元死亡和脂质过氧化[25]；对谷氨酸、连二亚硫酸钠和氯化钾造成的PC12细胞损伤模型有显著保护作用，可能与抑制细胞内钙超载、对抗自由基氧化损伤和谷氨酸兴奋性毒性有关[26]；抑制海马区Aβ的沉积和神经炎症[27]；提高海马齿状回胆碱能阳性神经纤维的数量和海马突触数量，改善突触后终末结构[28]。

近十年来，涌现出更多的相关研究，进一步证实当归芍药散能通过调节多种途径改善AD。譬如，其能有效改善侧脑室注射Aβ诱导的AD小鼠模型的认知功能障碍，缩短SAM-P8小鼠AD模型Morris水迷宫实验中延长的潜伏期、明显改善Aβ诱导的海马CAl区LTP抑制、减低海马区神经元损伤及脑组织中Aβ的含量和沉积[29,30]；改善D-半乳糖致衰老小鼠的学习记忆能力，提高大鼠血清SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）含量，减少丙二醛（Malondialdehyde，MDA）以及脑内Aβ含量，从而提高脑组织抗氧化能力和降低中枢系统神经毒性[31]；能显著降低Aβ1-42诱导AD大鼠模型海马组织内IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达，显著减轻海马神经元凋亡、减轻脑内炎症反应，提示减轻脑内炎症反应、抑制神经元细胞凋亡是DSS改善AD大鼠学习和记忆能力的机制之一[32]；降低脑内炎症因子IL-1β、IL-6的过度表达，抑制磷酸化MAPK信号分子p-p38、p-JNK、p-MEK的过度表达，减轻纤丝状Aβ42诱导的AD海马组织炎症损伤[33]；对D-半乳糖衰老模型小鼠具有神经保护作用、抑制氧化应激诱导的神经细胞凋亡[34]；抑制核因子-κB的表达，增强SOD和GSH-PX的活性[31]；当归芍药散提取物能改善D-半乳糖AD模型小鼠的一氧化氮合酶、羰基蛋白、MDA、GSH和NO的异常表达，改善中枢胆碱能系统功能，调节Bcl-2、Bax和caspase-3的表达，改善海马区神经元存活率[35,36]；抑制小胶质细胞的激活及IL-1β、IL-6等前炎症因子的产生，进而抑制Tau蛋白的过度磷酸化[37]；改善SAM-P8小鼠AD模型认知功能，增加雌二醇特别是在雌性小鼠中的表达，可能与雌激素改善受AD影响的大脑区域血流有关[38]；有效清除机体内自由基，提高机体内超氧化物歧化酶活性[39]；改善D-半乳糖结合AlCl3致认知障碍模型小鼠学习能力和记忆能力，明显升高损伤小鼠血中SOD和GSH-Px活性，降低损伤小鼠血中MDA和脑中脂褐素的含量[40]；明显减轻铜离子（Cu2+）介导的Aβ聚集导致的人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞损伤，使Aβ内吞，减少胞外Aβ聚集，提高细胞生存率[41]。

鉴此，现阶段实验研究证实当归芍药散“肝脾同调-血水同治”干预AD的作用机制涉及胆碱酯酶、神经递质与受体、炎症反应、氧化损伤、雌激素与自由基等方面，促进症状改善、并调控疾病进程的关键因素，提示其通过多途径、多靶点治疗AD，部分阐释了作用机制。但上述作用机制研究均侧重探讨当归芍药散对错误折叠蛋白质的毒性及后续效应的影响，未涉及其对降解代谢途径的影响[42,43]。

3 当归芍药散“肝脾同调-血水同治”调控UPP治疗AD的作用机制假说

3.1 UPP是治疗AD的有效靶点，具有明显优势

AD特征性病理改变为神经元大量丢失、细胞外Aβ聚集形成的老年斑（Senile plaques，SPs）和细胞内过度磷酸化Tau蛋白造成的神经原纤维缠结（Neurofibrillary tangles，NFTs），其中SP和NFTs是AD诊断及区别于其他痴呆类型的主要特征[44]。大脑神经细胞要维持正常的生命活动，必须在进行合成代谢的同时，及时将代谢废物排除胞外。而UPP为目前已知的最精细的蛋白降解途径，是真核细胞内蛋白质降解的主要途径之一，能够识别多余的和错误折叠的蛋白质，85%以上的蛋白质通过UPP进行降解。主要由泛素（Uniquitin，Ub）、泛素相关酶（特异性泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3）、去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes，DUBs）、蛋 白 酶 体（Proteasome，PS）及其底物组成。

UPP在AD的发生发展进程中扮演了极其重要的角色。1987年，George等[45]首次报道在死亡AD患者脑内SP和NFTs双螺旋细丝上发现了泛素。随后，数项研究证实AD患者大脑存在Ub表达异常、DUBs氧化、E3活性抑制、突变泛素积累、蛋白酶体亚基出现、PS活性下降[46,47,48,49]、泛素羧基端水解酶-1（Ubiquitin Cterminal hydrolase L1，UCHL1）、UCH-L3和UCH-L5的异常表达[50,51,52,53]，提示UPP功能障碍与AD脑内Aβ沉积、Tau蛋白磷酸化等关系密切。譬如，类泛素蛋白Ubiquilin-1能抑制APP在神经元中聚集，而AD患者大脑中其蛋白水平明显降低，导致APP聚集，从而促进Aβ的生成和沉积[54,55,56]；Lopez等[57]通过在原代培养的星形胶质细胞中加入蛋白酶体抑制剂乳胞素以抑制26S蛋白酶体的活性，结果发现Aβ42的降解明显减少，表明26S蛋白酶体直接参与Aβ42降解，提示UPP功能障碍可抑制Aβ降解。Della等[58]在非泛素化重组的Tau中加入纯化的20S蛋白酶体，Tau蛋白被降解，表明Tau降解存在UPP依赖性。又如，Graham等[59]发现UCHL-1对异常Tau蛋白具有降解功能、与AD脑中NFTs数量成反比，UCHL-1蛋白活性的增强可降低脑内Aβ和NFTs的水平[60]，提示UPP功能下降会促进Tau蛋白过度磷酸化。此外，研究已证实Parkin、CHIP等多种E3连接酶参与调控了AD重要效应分子tau蛋白降解、Aβ清除和降低Aβ毒性，CHIP能泛素化Tau蛋白、促进异常磷酸化Tau蛋白降解，提高CHIP水平可改善Tau的聚集和NFTs的形成[61,62]。因此，通过干预UPP研制切实有效的治疗AD的药物及阐明其作用机制已引起广泛重视[63,64,65]。

同时，目前抗AD在研药物主要包括Aβ形成抑制剂、聚集抑制剂，Aβ清除剂及Tau聚集抑制剂，但临床试验多以失败告终，“一药一靶”的药物研究思路受到挑战，提示针对单一因素或靶点难以治疗AD[66]。而UPP作为一个蛋白降解系统，从多途径、多机制调控AD的发生发展，按照拓扑网络模型理论，在一个系统中对3-5个因素（相当于药靶）的部分抑制即可达到对单一最重要因素的完全抑制效果[67]，而且，多靶向药物的亲和力相对较低，局部作用于相应靶点便能产生足够疗效，且不会完全抑制靶点承担的某些生理功能，还可通过发挥缓冲作用来稳定复杂网络系统[68]。相对于单靶向药物，多靶向药物具有提高临床疗效、减少不良反应、降低临床使用剂量和减轻耐药副反应等优点。因此，调控UPP治疗AD具有明显优势，是非常有前景的治疗AD的靶点。迄今，已有硼替佐米、卡菲佐米及碘沙唑米等以UPP为靶点的蛋白酶体抑制剂类药物获得美国FDA批准上市用于癌症治疗，也为将UPP作为治疗AD的靶点进行药物研发提供了启示[69]。

3.2 当归芍药散“肝脾同调-血水同治”调控UPP治疗AD的作用机制假说

UPP能降解不能正常工作的或者无用的蛋白质来维持细胞正常功能，清除结构异常的蛋白垃圾、调节细胞凋亡[70]。若UPP功能出现障碍，会影响蛋白质未折叠和折叠错误导致的垃圾和毒素的清除，不能及时有效地清除Aβ和磷酸化Tau蛋白，导致AD发生发展。取象比类，祖国医学认为AD多因患者年老体衰，因虚致瘀、痰内生，浊邪蒙窍，脑失所养所致。现代医家多从“毒”来论治AD，何为“毒”？《金匮要略心典》曰“毒，邪气蕴结不解之谓”，王永炎院士提出“毒损脑络”的理论，认为脏腑功能和气血运行失常，使体内生理代谢产物或痰浊、瘀血等代谢性病理产物未及时排出，体内蓄积过多则为“毒”，最终导致AD的发生发展。

而“毒”产生的根本原因，我们认为肝、脾是其核心。①脑为髓海，“髓之虚实，主于肝胆”（《删繁方》）。肝藏血主疏泄，体阴而用阳，为刚脏、寓生发之气，主升主动，条畅全身气机，是脏腑功能活动基本形式的概括。“一阳发生之气起于厥阴，而一身上下，其气无所不乘，肝和则生气，发育万物，为诸脏之生化。”（《杂病源流犀烛》），提示其疏泄功能的实质是气的生命动力在脏腑功能上的体现，为全身气化之总司，调畅全身气机、推动血和津液运行，促进精、血、津液运行、输布。若肝之疏泄怫郁，当升不升，当降不降，当化不化，精、血、津液运行、输布受阻，或凝而为瘀，或聚而为痰，病理产物凝聚于体内为“毒”，进而“毒”损脑络，发为痴呆。②脾者，谏议之官，藏二神意与智，意不安、思无虑，神夺愚也。脾主统血、运化水谷精微与水液，位居中焦，是人体气机升降的枢纽，为斡旋启承的关键。《素问·经脉别论篇》曰：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀胱，水精四布，五经并行。”强调只有脾“散”精的功能正常才能化生精、气、血、津液，并完成精微物质的运化、传输，营养脑窍、脏腑、经络、四肢百骸及筋肉皮毛。若其运化失施，或致气血乏源、脑髓空虚；或因“脾主湿，湿动则为痰”，致水液停留、聚而成痰，病理产物堆积，上蒙脑窍、神机失用；或由统血无力、血溢脉外而成离经之血、瘀阻脑络；或痰浊、瘀血等“毒”邪胶结为患，发为AD。综上，UPP作为体内的“清洁工”，其生理作用与功能状态均具有疏通调和的特点、以畅达为至要；与中医的肝主疏泄、条畅气机的“用阳”之性，脾主运化、代谢水湿的“散精”之性十分吻合。而肝气郁滞、脾气虚弱，气机不畅、运化无权，致脂质、蛋白质、微量元素、糖类等精微物质不能正常转输、布散而产生瘀血、痰浊等代谢降解病理产物内聚于体内，“毒”蒙脑窍，神机失用为呆；这又与现代医学中UPP功能障碍影响蛋白质未折叠和折叠错误导致的垃圾和毒素的清除，导致Aβ和过度磷酸化Tau蛋白不能及时有效被降解，进而发生AD“异曲同工”。

经方当归芍药散血水并治以驱其“毒”、肝脾同调以复其脏，临床应用治疗AD已获得确切疗效。方中当归、白芍柔养肝血，是顾“肝体阴而用阳”之性；当归、川芎活血化瘀，是通其瘀滞；三药合用，既可养血柔肝，又可活血化瘀以条达肝之气机、祛瘀生新；且3味同入血分行血瘀、具养肝缓急之效。白术益气健脾燥湿，是恢复脾运；茯苓、泽泻利湿，是泻其水邪；三药合用，益气健脾的同时，又可燥湿化痰，脾健则水谷精微正常运化，水湿痰浊生成乏源。方中药物一入血分疏肝解郁，一入气分健脾化湿。《金匮要略·水气病》云，“血不利则为水”，本方六药同用，泻中寓补，具柔肝健脾、行血利水之功效。且方中芍药用量独重以柔肝；重用川芎、泽泻以疗互结之痰瘀。凡用此方可使肝体得柔、肝用得舒，脾气得养、脾运得健，血水同治，切中AD发生发展进程中肝郁脾虚、痰瘀等毒邪阻窍的病理环节。方剂学大家陈潮祖老先生认为此方较逍遥散、四逆散、柴芍六君之类尤为灵动，用之常获良效。而且，已有研究证实当归芍药散治疗AD的主要有效成分之一芍药苷能显著上调UPP，促进α-突触核蛋白降解，减少细胞损伤[71]。

鉴此，本课题组提出当归芍药散可通过“肝脾同调-血水同治”调控UPP治疗AD的作用机制新假说。同时，为进一步验证此假说，深入揭示其作用机制，本课题组正开展后续系统研究。目前，通过采用当归芍药散含药血清干预Aβ1-40诱导的AD细胞模型已初步证实其可通过调控UPP发挥治疗AD的作用。

4 小结与展望

综上，AD病理机制复杂，现代医学用于治疗AD的药物多为对症治疗、多以单一靶点为治疗目标。而中药复方重视整体调节和平衡，其基础是活性物质群，往往具有多效性，可调节AD相关的多个信号通路或靶标，具有一定的治疗优势。当归芍药散肝脾同调、血水同治治疗AD，组方精妙、临床疗效确切，可通过调控胆碱酯酶、神经递质与受体、炎症反应、氧化损伤与自由基等多途径、多靶点发挥治疗作用，且可能会通过调控UPP——这一目前所知最精细的蛋白质降解途径发挥治疗作用。本课题组正立足于该假说，在动物、细胞实验及临床试验等方面开展更深入的研究，以期进一步揭示其作用机制、积极阐释古方的科学内涵、更好地为现代临床治疗服务。