结节性硬化病人临床表型及遗传学分析

陈 健，王建斌，郝晓燕，孙海瑞，何怡华

结节性硬化(tuberous sclerosis complex，TSC)是一种常染色体显性遗传疾病，其在正常人群中的发病率为1/6 000～1/10 000[1-2]。TSC病人的临床表型和症状往往差别较大，最常见的临床表现包括智力障碍、孤独症或癫痫等中枢神经系统症状，其主要由皮质及室管膜下病变引起，少数由未分化的巨细胞瘤引起[3-5]。累及多系统的错构瘤形成则是另一种主要表现，可见于皮肤、肝脏、肾脏、肺部[6]。大多数情况下，病人都是因为明显的皮肤症状或癫痫前来就诊。传统的TSC诊断标准主要以临床表型为基础，对于临床表型不典型的病人诊断常较困难。2012年修订的TSC诊断标准将TSC1和TSC2基因的致病突变作为一项单独的TSC基因诊断标准[7]，上述两个基因分别位于9q34和16p13.3，9q34包含23个外显子，16p13.3包含41个外显子[8]。这两个基因均为肿瘤抑制基因，分别编码形成错构瘤蛋白和马铃薯蛋白，并形成一个主要的雷帕霉素受体复合体1(the mammalian target of rapamycin，mTORC1)，控制细胞的增殖、分化、黏附生长和迁移，对于mTORC1的靶向治疗成为目前研究的热点[9]。除此之外，两个基因还在大脑皮质分化和生长控制方面起着重要作用。在新近研究报道的TSC突变中，TSC新发突变的比例超过2/3[10]。

虽然越来越多的TSC基因突变被报道，但特定突变与特定表型之间的对应关系尚不清楚，常可见相同家系突变在亲代和子代病人中的表型存在较大的差异[11]。本研究对42例临床确诊为TSC的病人进行家系临床表型和遗传学分析，探讨不同突变与临床表型之间可能的关联。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究系一项前瞻性研究，经首都医科大学附属北京安贞医院伦理委员会批准。通过与TSC中国协会合作，于2015年9月—2017年12月入组42例独立的TSC病人及其家系，所有病人都被临床确诊为TSC。对所有病人及直系亲属进行了TSC1和TSC2目标基因检测。经北京安贞医院伦理委员会批准，所有接受基因检测病人家系均需签署知情同意，表示知晓本研究情况并同意接受基因检测。

1.2 临床表型采集 主要采集临床表型包括面部血管纤维瘤或前额斑块、非外伤性指(趾)甲或甲周纤维瘤、色素减退斑(≥3)、鲨革样皮疹(结缔组织痣)、多发性视网膜错构瘤结节、皮质结节、室管膜下结节、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、单个或多发的心脏横纹肌瘤、肺淋巴管性肌瘤病、肾血管平滑肌瘤。所有病人的诊断均由一位有经验的临床医生独立完成。

本研究中所有病人临床诊断依据2012年国际TSC大会修订的TSC诊断标准，大多数先证者都有典型的皮肤和脑部病变[7，10]。所有病人都接受了高分辨率的脑部核磁(MRI)或电子计算机断层扫描(CT)。所有病人症状及体征采集均由一位有经验的医生完成，且不知晓其基因突变结果。

1.3 DNA样本采集 对家系先证者及其相关家系成员采集外周血样，采集部位为外周静脉，使用4 mL EDTA抗凝管，每人2管，冷藏保存运输。所有样本若不能立即送检，则置于-20 ℃冰箱或-80 ℃液氮罐中保存。

1.4 TSC目标基因检测 使用标准程序分别在组织、羊水及全血中提取DNA样本。通过多重PCR和Illunina模块顺序扩增TSC1和TSC2外显子。使用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)检测TSC目标基因大片段的重复或缺失。

DNA提取：使用BloodGen Midi Kit (CWBIO， China)提取病人DNA并进行质控，具体要求为：DNA浓度要求至少达到30～50 ng/μL，不能有降解，不能有RNA污染。

多重PCR方法构建文库：定制罗氏NimbleGen捕获探针进行目标基因全外显子捕获。使用同一PCR体系加上二对以上引物，产生多个核酸片段的PCR反应，完成DNA 文库构建。文库构建完成后，取1 μL捕获文库用于Qubit定量，然后适当稀释文库用Q-PCR检测文库浓度，以保证文库质量并达到以下标准：浓度≥10 nm(qPCR定量浓度)；文库检测后剩余体积≥10 μL。

测序：将所取标准文库样本在Illumina hiseq2500平台使用标准操作流程上机测序：选择高通量模式——PE100 测序。测序得到图像原始数据，应用Illumina官方basecall分析软件BclToFastq得到原始数据，并进行原始数据去接头质量过滤。数据分析：原始数据产量统计、比对、SNP检测及注释、Indel检测及注释、突变假阳性过滤、突变注释等生物信息学分析。有疑似位点的样本需要进行一代测序(Sanger法)验证。

1.5 报告解读 临床医生与生物信息专员共同对病人家系基因结果生物学信息、临床表型、临床症状及治疗情况等进行匹配、个体化综合分析，最终做出基于临床基础的基因诊断报告。

2 结 果

42例病人及家系都成功接受了家系基因检测，其中39个家系中每个先证者中均检测出单个TSC突变，其中2个突变分别在不同的病人中检出2次和3次，合计共36个不同的致病或疑似致病性突变，包括14例无义突变，12例移码突变，4例错义突变， 2例剪接突变，4例大片段缺失；另外3个家系TSC目标基因检测均为阴性(见表1)。在检测出突变的39个家系中，新发突变为34个，家系遗传突变为5个。

表1 42例病人TSC基因突变特征

2.1 TSC1突变情况 在本研究42个家系中，检测出TSC1突变6例(14%)，其中5例为新发突变，1例家系遗传突变。分别是3例无义突变，2例移码突变，1例大片段缺失，均为致病性或疑似致病性突变，突变位置集中于8、9、11、14、18号外显子(见表1、表2)。

表2 TSC1和TSC2基因突变情况 单位：例

2.2 TSC2突变情况 共有33个家系先证者检测出TSC2突变(79%)，其中29例为新发突变，4例家系遗传突变见表 1。包括11例无义突变，10例移码突变，4例错义突变，3例大片段缺失，2例剪接突变，所有突变均为致病性或疑似致病性突变。这些突变中所有点突变的位置集中于16个外显子及1个内含子，其中累及次数最多的位置为41号外显子，共有5个不同的先证者均被检测出该位置致病突变；2个大片段缺失突变累及1～16号外显子。

2.3 TSC表型特征 所有TSC症状及体征数目分布及其在不同基因型中的占比显示，男性占多数，共31例(74%)。详见表1。42例病人不同TSC表型特征与基因型分析见表3。在所有病人相关的TSC表型中，最常见的体征为脑部室管膜下结节(见图1)，在39例病人中出现，占比93%，其次是皮肤色素减退斑(见图2)，为38例(90%)；最常见症状为癫痫，出现病人38例(90%)，这也是大多数病人就医的原因。皮肤症状和脑部组织是所有病人中最常见的表现，均在超过一半的病人中出现。

表3 42例病人不同TSC表型与基因型分析 单位：例(%)

图1 脑部CT显示患儿多发室管膜下结节(箭头所示)

图2 病人右侧腰部皮肤多发白斑(箭头所示)

3 讨 论

本研究中被检出携带TSC2基因突变的病人占大多数，但无论是TSC1和TSC2突变，经临床确诊的病人在表型上差别不大，如决定病人症状严重程度的重要指标——智力状况，在TSC1突变病人中，仅有4例(4/6)出现了智力减退表现，而在TSC2病人中，有23例(70%)出现智力减低，这与既往报道并不一致[12-13]。本研究中TSC1病人较少可能是原因之一。在新发和家系遗传突变比例上，TSC1基因和TSC2基因差别也不大，前者家系遗传1例(1/6)，后者家系遗传4例(12%)。

一些致病位点的较高频率突变值得关注。TSC2基因41号外显子被检出5个致病或疑似致病突变，其中3个为已经有文献报道证实致病的错义突变，另外2个为移码突变，虽未见报道，但生物信息分析结果为多个核苷酸的缺失会导致编码蛋白质的改变，从而影响功能，高度疑似致病突变。5例病人均有较严重的TSC症状，所有病人都出现了癫痫发作，4例病人出现智力减低，并且出现症状相对较晚，平均诊断年龄为3岁。

两个点突变在不同病人身上被重复检出。其中点突变TSC2：c.3412C>T (Exon30)在3例不同病人身上被检出，该突变可造成编码蛋白的1 138位氨基酸由精氨酸(R，Arg)变异为终止密码子(X)，且相对原来缩短670个氨基酸，因此，考虑为致病突变。除此之外，该突变也已经有相关疾病报道[14]。3例病人均在0～1岁出现首发症状癫痫，3例患儿均出现室管膜下结节和多发色素减退斑，其中2例出现智力减退表现。TSC2：c.5228C>T(exon41)则是另一个在2例不同病人身上被检出的致病点突变，该位点的突变导致1 743位的氨基酸由精氨酸(R)变为谷氨酰胺(Q)，可以造成编码蛋白序列的改变，对其结构和功能造成严重影响，已有文献报道该致病位点上的相同类型氨基酸变异[15]。携带上述突变的两例病人均出现较严重症状，包括癫痫、智力减低、室管膜下结节和皮质发育不良、皮肤多发色素减退斑，同时多发牙釉质改变和多发心脏横纹肌瘤也分别见于其中1例病人。

本研究中共有3例病人及其家系TSC目标基因检测结果为阴性，3例临床症状及体征均相对较轻，其中2例患儿出现癫痫症状，但用药后均明显好转；除1例患儿智力可疑减退外，另外2例患儿均无明显智力减退表现。但由于此次检测基因采样位置为外周血，未排除嵌合体的可能[16]，目前正在进行下一步的多位置样本采集，特别是病变部位。家系突变的比例在本研究中较少，仅有5例(12%)，其共同的特点是亲代临床表型较子代轻，特别是神经系统症状，亲代都没有明显神经系统症状，智力也无明显减退，而在子代中有4例先证者患儿出现神经系统症状和智力减退表现。同一位点突变在亲代和子代之间的差别机制尚不明确。本研究是一项单中心的前瞻性研究，在42例临床确诊的TSC病人中检测出36个不同的TSC1/2致病突变。无义突变和移码突变是最常见的TSC致病突变。TSC2的致病突变在所有检出突变中占大多数，但本研究中TSC1和TSC2基因突变的TSC病人在临床表型上差异不明显。3例(7%)病人常规外周血基因检测阴性，这与既往报道相符，不能除外部分病人为体细胞或生殖细胞嵌合体的可能[16-17]。

本研究入组样本量较少，部分TSC的症状和体征在本研究中并未发现。对于连续检出的高频突变，需要进一步的功能验证明确证实其致病性。