顺铂诱导急性肾损伤研究进展

庞 硕 综述 孔德阳 审校

顺铂(CDDP)作为临床高效广谱抗癌药物，其肾脏转运受近端小管转运蛋白调节，在肾近端小管上皮细胞(proximal tubular epithelial cells，PTECs)蓄积致细胞发生炎症、损伤和死亡，使30%～40%接受CDDP治疗患者遭受肾毒性[1]：表现为急性肾损伤(AKI)，血清钠、镁丢失及尿液浓缩功能障碍等；其中，AKI是CDDP诱导肾毒性的主要并发症。一些生物标志物[如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤分子1(KIM-1)及胱抑素C(CysC)等]已应用于AKI临床及基础研究检测。然而，受患者年龄、性别及原发病等因素影响，尚无一个AKI生物标志物被普遍应用于常规临床实践。

尽管，应用啮齿类动物对CDDP-AKI进行了积极的基础研究，迄今为止，为建立易于检测的现有生物标志物的啮齿类动物AKI模型，CDDP仍需大剂量给药，致模型与临床病例尚存差异。因而，进一步寻找新型AKI生物标志物，完善动物模型并确定治疗新分子靶标至关重要。最近，该领域扩展了CDDP-AKI模型的类型，活性氧(ROS)和线粒体功能障碍所特有的CDDP诱导的损伤发病机制，特别是细胞死亡途径、炎症反应、自噬以及Klotho等在AKI中的作用。

CDDP的肾脏代谢

CDDP在PTECs浓度近5倍于血液浓度[2]，非毒性剂量的血液浓度可在肾脏达到毒性标准，严重损伤肾小管S3段致肾脏失功。CDDP细胞摄取受肾小管基膜侧内流蛋白影响，如有机阳离子转运蛋白(OCTs)和铜离子转运体(CTRs)；CDDP分泌进入尿液受顶端定位的外排转运蛋白调节，如多药耐药相关蛋白(MRPs)及多抗菌挤压蛋白(MATEs)等。上述转运蛋白在肾小管高表达，CDDP给药后表达与定位均发生异常，靶向抑制或激活上述转运蛋白已成为CDDP-AKI治疗的新方向。西咪替丁可竞争性抑制肾脏OCTs，被推测有肾保护作用，然这一理论在利用马丁大比犬肾细胞进行的研究中未得到证实[3]。CDDP抗癌治疗作用受表达在癌症细胞转运蛋白调节，因此利用肿瘤鼠模型检测靶向CDDP转运蛋白肾保护作用的治疗十分重要。

血清镁作为CDDP转运蛋白表达的关键调节者，在CDDP治疗后浓度显著降低。镁缺陷时，外排转运蛋白表达降低使CDDP蓄积在肾小管细胞，AKI易感性增加。Kumar等[4]报道，补充镁发挥CDDP抗癌作用同时降低AKI发生率。

CDDP-AKI模型建立

非合并肿瘤模型当前，CDDP-AKI研究主要应用两种肾毒性啮齿类动物模型，即短期高剂量和长期低剂量方案：前者单次大剂量CDDP 20～30 mg/kg给药，3～7d后导致肾毒性；后者在3～4周内CDDP 5～15 mg/kg 给药，2～4次。模型鼠多应用 6～10周龄雄性C57BL/6小鼠，然而，雌性C57BL/6小鼠注射CDDP后更易诱导AKI发生[5]。此外，与幼龄大鼠相比，16～17月龄大鼠CDDP-AKI易感性更高。模型均使用血清肌酐(SCr)，尿素氮(BUN)，CysC，KIM-1，NGAL及CC趋化因子配体2(CCL2)等作为检测指标；新型生物标志物[5-6]，如尿液肾特异性miRNA，给药18h后升高；尿液Wnt4及ARL13B，给药后24h升高。

合并肿瘤模型非合并肿瘤模型是了解CDDP-AKI炎症，细胞凋亡，ROS和细胞群介导炎症致病机理的基础，但两种模型还原患者临床实际方面尚存不足。如，CDDP在实体肿瘤患者是以低于10 mg/kg剂量长期给药[7]。然而，大鼠模型很少持续应用CDDP低于10 mg/kg，且未纳入对合并肿瘤AKI大鼠模型的研究。某些小鼠品系对肾毒性物质更具耐受力，需要超出临床相关剂量才能产生类似CDDP-AKI表型，从而突出了临床相关小动物模型的改进空间及从基础到临床转化的固有困难。

围绝经期妇女接受CDDP抗癌治疗AKI发病率远高于同龄男性；当前动物模型中在年龄和性别上均未体现；迄今，探究癌症患者CDDP-AKI 的预防性治疗甚少。因此，更适用的动物模型(即接受常用剂量方案合并肿瘤的高龄小鼠)将大大改善模型的可重复性。进行预防或干预性研究，解决CDDP-AKI的病理生理并解释性别和体内肿瘤关系非常重要。

合并肿瘤的CDDP-AKI模型多是同种异体移植模型，宿主具有免疫功能，移植潜伏期短，由于缺乏小鼠细胞系而受限[8]，如鼠源性EL4淋巴瘤细胞、H22肝细胞癌及CMT167肺腺癌等。在快速 CDDP-AKI 模型中，同种异体移植需要7～10 d形成实体瘤。肿瘤形成后，单剂 CDDP 20～25 mg/kg 给药；长期模型允许在快速 CDDP-AKI中观察到肿瘤植入，而后每3～7d进行CDDP 3.33～10 mg/kg治疗，持续3～4周。

病理生理机制

细胞应激状态线粒体功能障碍与氧化应激是 CDDP-AKI的标志。CDDP能够引起线粒体功能受损，氧化应激增加伴内源性抗氧化酶表达失调。使用靶向促进线粒体生物发生，增强线粒体动力学或增加内源性抗氧化剂，能够减少氧化应激和细胞死亡起到肾保护作用。CDDP直接和间接调节线粒体功能，在受体介导内吞作用下水解为正电荷分子，直接破坏线粒体复合物导致ROS产生增加。CDDP-AKI最新研究集中于间接影响，如上调miR-709与线粒体转录因子(如线粒体转录因子A)相互作用并进行抑制[9]。

CDDP引起线粒体ROS产生增加同时降低内源性抗氧化酶表达增加，导致ROS在细胞内蓄积引发氧化应激，致丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)及核因子E2相关因子2(Nrf2)等多种信号通路失调[10]。新型抗氧化剂通过增加内源性抗氧化剂减轻CDDP-AKI。抗氧化剂透过质膜并定位在ROS产生部位-线粒体可以更好地发挥作用，因此，靶向线粒体抗氧化剂已被用作CDDP-AKI新型抗氧化剂干预治疗[11]。

氧化应激主要下游事件是细胞死亡， ROS可以激活死亡受体，线粒体和内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介导的凋亡途径。线粒体完整性丧失是导致ROS过度产生，降低ATP释放,细胞应激和死亡加剧的关键因素，靶向这些过程可以防止氧化应激不良的下游事件。

细胞死亡

细胞凋亡 细胞凋亡主要由半胱天冬氨酸蛋白酶 caspases 介导， caspase-3是CDDP-AKI中涉及主要的胱天蛋白酶，一条或多条凋亡途径可激活caspase-3，即外源性、内源性或 ERS介导的凋亡途径。

外源性途径由凋亡受体激活细胞内胱天蛋白酶介导。Fas 配体(FasL)表达于淋巴细胞等免疫细胞表面，并与靶细胞Fas受体结合(如圆锥绣球[12]可减少FasL在CDDP给药后引起的肾脏表达上调)。肿瘤坏死因子α(TNF-α)与TNF-α受体结合是CDDP-AKI模型中常见凋亡刺激因素。然而，TNF-α可以通过 caspases 和 NK-κB 通路分别促进细胞的凋亡和生存。上述受体激活的主要胱天蛋白酶启动子是caspase-8， CDDP给药后表达上调，苏拉明可以降低其表达[11]。

内源性途径部分由线粒体功能障碍介导。肿瘤抑制蛋白p53是AKI 模型中关键的凋亡刺激因素。DNA受损激活p53，抑制线粒体膜上抗凋亡蛋白，如Bcl家族。研究表明，CDDP 作用鼠通过p53活化下调 Bcl-2 表达[13]。在缺乏抗凋亡蛋白的情况下，线粒体膜透性化发生，线粒体中细胞色素 c 等释放进入细胞质，通过切割 caspase-9激发caspase级联反应。睡莲和七神益气丸通过保护线粒体功能和降低 caspase-9分裂，减少线粒体导致的细胞死亡和肾小管损伤[14-15]。此外，桑色素(黄烷醇)水合物能够直接抑制 p53激活可保护 CDDP-AKI诱导的肾小管细胞死亡[16]。然而，具有抗凋亡特性的药物也可能由于抑制癌细胞凋亡而促进癌细胞生长。

ERS是CDDP-AKI重要调节者，有三种主要 ERS 感受器，包括肌醇蛋白1(IRE1)，蛋白激酶R(PKR)-类内质网激酶(PERK)，激活转录因子6(ATF6)。正常情况下，这些感受器处于非活性状态，与Bip/GRP78和XBP结合。CDDP给药后上述标志物被释放，激活且丰度增加。多胺分解代谢增加是ERS的标志。CDDP治疗与多胺分解代谢相关酶的表达增加有关，如 SMOX 和 SSAT，此两种酶基因突变可阻断CDDP诱导的ERS依赖的凋亡途径。研究表明，高同型半胱氨酸血症(HHcy)可诱导内质网氧化还原酶表达，如Ero1α；非CDDP-AKI情况下，合并HHcy的鼠Ero1α活化增加，产生过量H2O2，未折叠蛋白反应活化及引发内皮炎症[17]。CDDP作用HHcy鼠后，ERS加剧合并重度肾小管损伤，更倾向发展为严重AKI[18]。

CDDP除介导caspase 级联的蛋白质间相互作用，还在转录水平调节凋亡蛋白。如给予CDDP后，凋亡基因甲基化失调；CDDP上调组蛋白去乙酰化酶(HDAC)2表达；HDAC 2与抗凋亡分子BMP-7启动子结合；研究表明，促红细胞生成素对CDDP诱导的肾小管上皮细胞凋亡具有保护作用[19]。令人惊讶的是caspase抑制剂，如zVAD-fmk在CDDP-AKI小鼠模型中，直接抑制细胞凋亡的效果较差，ANT和凋亡评分也更差[20]，提示由泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂或直接自噬抑制剂引起的自噬通量受损，加重CDDP-AKI。

细胞坏死和坏死性细胞凋亡 细胞坏死和非程序性细胞死亡，可见于伴随细胞凋亡的AKI鼠模型中。此外，新的凋亡-坏死杂合途径，即坏死性细胞凋亡，参与了CDDP-AKI。坏死性细胞凋亡是程序性细胞死亡，由受体相互作用蛋白激酶(RIPK)和混合谱系激酶结构域(如MLKL)协同激活介导，导致细胞透化。caspases除在凋亡中发挥作用，还可通过与PIPK相互作用在坏死性细胞凋亡机制中发挥作用。在CDDP给药时，RIPK1、RIPK3、pMLKL及caspase-8表达上调，敲除MLKL或RIPKs的小鼠其肾小管坏死及损伤减轻[21]。目前，持续性坏死介导CDDP给药后从AKI到CKD的转化是坏死治疗干预的重要靶点。

细胞焦亡 细胞焦亡又称细胞炎性坏死，属程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，细胞内容物释放进而激活强烈炎症反应。最初在几种吞噬细胞中发现，如巨噬细胞及单核细胞；最近，在肝细胞、神经元细胞及肾小管上皮细胞亦被发现。Li等[22]证实，GSDMD活化通过靶向细胞焦亡促进了CDDP-AKI，靶向GSDMD 或GSDMD N端结构域(GSDMD-N)的预防性治疗或许是临床有前景的治疗策略。

CDDP-AKI与炎症

细胞因子 在CDDP可诱导前炎症细胞因子和趋化因子，导致肾脏组织损伤和肾衰竭进展。Volarevic等[23]证实，抗炎细胞因子IL-10能够减轻CDDP诱导的肾组织损伤和肾小管细胞死亡。炎症反应的作用通过靶向特异性炎症因子TNF-α进一步证实。CDDP可增加血清和尿液中TNF-α的浓度，受IL-1，NF-κB，Sir1和Deptor刺激后，受损的肾小管、成纤维细胞、角质形成细胞、巨噬细胞和白细胞产生TNF-α。例如，IL-1受体敲除小鼠(IL-1R1-/-)表现出CDDP-AKI减轻和肾脏TNF-α水平降低[24]。

炎症细胞 趋化因子促进白细胞募集到损伤部位，大量炎性细胞通过释放细胞因子,髓过氧化物酶(myeloperoxidases，MPO)和ROS等直接损伤组织，增加血管通透性并损害内皮功能。黏附分子介导白细胞黏附于其他细胞定位于炎症特定部位。黏附分子CD54+(ICAM1)在TNFα刺激下在血管内皮上表达。连接黏附分子C(JAM-C)可阻止嗜中性粒细胞从炎症组织运动返回体循环，逆向内皮迁移[25]。 JAM-C阻断抗体已显示可从CDDP诱导的炎症组织中去除CD54+中性粒细胞，从而减轻炎症反应和改善CDDP-AKI。

在CDDP-AKI中，激活的CD4+T细胞侵入肾脏，产生细胞因子(例如TNFα)介导损伤。此外，活化的CD4+T细胞表达并脱落死亡激活因子Fas配体(FasL) 和T细胞免疫球蛋白黏蛋白(Tim-1，Hcvr1，Kim-1)，介导细胞凋亡(FasL)和受体介导的吞噬作用(Kim-1)损伤肾小管细胞。然而，遗传性CD4耗竭研究证明了对CDDP-AKI的保护。此外，在合并肿瘤AKI小鼠模型中，CD4耗竭不能抵抗CDDP-AKI并导致肿瘤负担加重，可能与调节性T细胞(Tregs)有关。磷脂酶A2可增加IL-10产生并在体内和体外扩大Treg种群，最终用于CDDP-AKI的治疗[26]。

肾脏MPO升高与中性粒细胞和巨噬细胞(Mφ)引起的肾损伤相关。CDDP诱导损伤后1～3d，可以确定Mφ(F4/80LoCD11bHi)和树突状细胞 [DC(F4/80HiCD11bLo)]浸润肾脏[27]。 DC/Mφ耗竭实验加剧了CDDP-AKI肾脏病变，表明DC/Mφ介导了肾脏损伤的保护作用[28]。相反，DC/Mφ消耗已显示可降低CDDP-AKI严重程度。关于DC/Mφ在CDDP-AKI中作用的矛盾数据集表明，需要进行更多的研究以更好地定义DC/Mφ亚型的作用和功能[27]。

自噬自噬是高度保守的细胞内溶酶体蛋白降解途径，是维持细胞内稳态的重要途径。损伤后自噬体标记物lc3-Ⅱ的表达多被认为是自我保护和防御机制。

HDAC6是自噬体成熟和自噬体-溶酶体融合的主要调节因子，CDDP-AKI刺激HDAC6的表达和活性。HDAC6抑制结果增加自噬蛋白的表达(ATG7，Beclin-1)。 HDAC6抑制和刺激自噬与减少肾脏氧化应激、抑制TNF-α和 IL-6表达、抑制生物标志物NGAL 和 KIM-1、抑制肾小管细胞凋亡最终减轻CDDP-AKI有关。同样，植物黄酮灯盏乙素[29]，被广泛研究的HDAC抑制剂(如二甲双胍等)以及外源性补充或增强自噬相关蛋白的表达(如14-3-3和 atg16l)均可通过增强自噬减轻CDDP-AKI[30]。

Klotho Klotho是存在于多种组织和细胞中的跨膜蛋白，尤其在肾脏近端小管高表达，分泌参与器官保护。Klotho细胞内形成能抑制炎症介导的衰老和矿物质代谢。在CDDP-AKI情况下，无论是人或啮齿类动物模型，尿液中Klotho水平均是降低的[31]。在Klotho缺陷小鼠中，CDDP给药前Klotho表达降低，加剧了CDDP-AKI。总之，Klotho表达与器官保护，降低氧化应激及调节生长因子信号相关。

CDDP-AKI 新型早期生物标记物

尿液外泌体尿液中的外泌体可来自肾单位每一部分，包括足细胞。外泌体由细胞在正常和病理条件下分泌，受RNA调控。在大鼠AKI模型发现活化转录因子3(ATF3)水平升高比SCr水平更早[32]。水通道蛋白2早期在尿液细胞外囊泡释放降低发生在SCr升高及小管损伤之前。人胚胎干细胞外泌体释放减轻CDDP诱导的氧化应激和细胞凋亡。总之，检测尿液外泌体转录因子对提供细胞调解途径的洞察和疾病早期生物标志物的发现十分有益。

miRNA miRNA是一类由内源基因编码长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子。研究表明，p53介导了CDDP诱导鼠肾小管上皮细胞miR-34a表达上调；抑制肾小管上皮细胞中miR-34a表达可促进细胞凋亡，miR-34a过表达可减少细胞坏死、增加细胞活力，提示miR-34a成为早期诊断CDDP-AKI生物标志物及为治疗提供新靶点的可能[33]。新近Kagawa等[34]发现，CDDP-AKI大鼠模型中，血液miR-143-3p和miR-122-5p表达下调，其变化显著于SCr变化。上述提示，miRNA或许成为CDDP-AKI早期诊断的生物标志物。

总结与展望

现阶段常用啮齿类CDDP-AKI动物模型，多为应用高剂量、幼龄及非肿瘤小鼠构建。尽管已有应用合并肿瘤小鼠构建的CDDP-AKI模型，但鼠龄及剂量方面需要进一步优化及改良，以提高临床相关性，进一步通过大量实验研究得出的基础数据更具说服力。

CDDP-AKI病理生理包括氧化应激、凋亡、坏死、炎症及自噬等，对上述任一环节进行调节都会减轻CDDP-AKI。尽管，大量实验研究对CDDP-AKI分子机制有了新认识，然而CDDP调节细胞存活、新陈代谢和免疫应答的信号传导途径多同时涉及CDDP对肿瘤细胞的细胞毒活性及其功能的潜在改变，可能减低CDDP 抗肿瘤效应。目前，AKI调节仍然是CDDP肾保护和肿瘤毒性之间的平衡点。建立不限制抗癌效应同时具有肾保护效应的新CDDP化疗方案，将显著提高CDDP临床应用价值，为化疗开辟新途径。