线粒体功能障碍与足细胞损伤的研究进展

杨倩倩 综述 孙 琦 杨俊伟 审校

线粒体起源于10亿年前被真核生物吞噬的a-放线杆菌，是真核细胞最主要的产能场所。线粒体由双层膜包被，外膜平整，内膜向线粒体基质凹陷，折叠成嵴，内外膜之间构成膜间隙。线粒体在呼吸过程中，将电化学势能储存在膜间隙内，在内膜两侧造成质子浓度差，形成膜电位。线粒体是一种半自主细胞器，其基质内包含一个环状基因组，即线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)，能够独立进行转录和翻译。线粒体基因组能够编码电子传递链相关蛋白，因此与细胞的能量供应密切相关。线粒体处在不停的动态变化中，不断地进行分裂与融合，以构建细胞内线粒体网络，确保其在细胞内的分布。除了给细胞提供能量外，线粒体还具有其他多种生物学功能，包括调节代谢途径，参与RNA及DNA合成，促进激素、氨基酸和脂质的合成等。此外，线粒体还可以在膜电位的驱动下，促进胞质Ca2+向线粒体内转运，控制细胞内Ca2+浓度的动态平衡。

肾小球滤过膜由三种不同细胞组成：内皮细胞、基膜和足细胞。足细胞覆盖在肾小球毛细血管外侧，位于滤过膜最外层，是维持肾小球滤过屏障完整性的主要组成部分。作为终末分化的细胞，足细胞几乎没有增殖能力。在足细胞受损丢失时，若残余的足细胞不能通过细胞肥大、足突融合以增加覆盖面积，则裸露的基膜将促进壁层上皮细胞活化增殖，这是一个不可逆的过程，将最终导致肾小球硬化的发生。因此足细胞损伤是肾小球疾病发生发展的关键步骤。足细胞需要大量ATP来维持自身复杂的结构和功能。因此阐明足细胞的能量供应方式尤为重要。本文介绍了足细胞能量供应方式以及线粒体对足细胞发挥正常功能的重要性。

足细胞能量代谢

足细胞结构与功能足细胞有三个主要的结构区域：胞体，初级突起和足突。正常情况下，足细胞通过足突依附在基膜上而胞体并不与基膜直接接触。足突是足细胞特有的结构，足突间呈拉链样互相交错形成裂孔隔膜，裂孔隔膜对于维持肾小球结构与功能的完整性十分重要。足细胞需要不断地合成基底膜主要成分和裂孔隔膜相关蛋白、并与内皮细胞相互作用，从而维持滤过屏障功能。

足细胞能量代谢途径每种细胞都有着自己独特的能量代谢方式。星形胶质细胞高度依赖糖酵解代谢产能，而神经元主要利用线粒体氧化磷酸化[1]。糖酵解亦是内皮细胞最重要的能量代谢方式[2]。因此，如何精细调节线粒体氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation,OXPHOS)和糖酵解供能比取决于不同细胞类型的代谢需求。

2010年Abe等[3]首次用鼠足细胞系研究足细胞能量代谢模式，运用海马细胞能量代谢检测系统检测细胞线粒体耗氧率(oxygen consumption rate,OCR)，发现线粒体69%的耗氧偶联ATP的合成，31%的耗氧用于质子漏的发生。羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)联合线粒体复合物I抑制剂Rotenone抑制60%ATP的产生，糖酵解抑制剂2-DG抑制25%ATP的生成。该作者认为足细胞主要利用线粒体代谢产能，糖酵解只占一小部分。2015年Ozawa等[4]通过对线粒体染色进行胞内定位，发现线粒体主要定位于核周。电镜结果显示，成年小鼠足细胞的线粒体主要位于胞体和初级胞突，足突内线粒体较少但糖酵解限速酶磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)较多。这种不同部位线粒体分布的差异提示其能量代谢方式不同。运用FRET-ATP指示系统发现足细胞胞体同时利用线粒体和糖酵解代谢产能，而足突主要利用糖酵解供能。作者发现，抑制糖酵解能导致足细胞凋亡、影响细胞迁移、抑制足突形成以及减少局部ATP的产生。表明糖酵解对于足突功能的重要性。同时作者检测了足细胞在分化过程中的代谢模式，未分化足细胞线粒体产能仅占胞内总ATP的 20%，分化完成后升高到50%。提示在足细胞分化早期糖酵解是主要产能方式，在足细胞分化完成后线粒体起重要作用。2017 年Imasawa等[5]研究得出类似的结论。相较于未分化的足细胞而言，分化成熟的足细胞线粒体氧化磷酸化产能是增多的，同时线粒体生物合成增多。我们实验室也做了关于足细胞能量代谢方式的相关研究[6]，发现在鼠足细胞分化过程中，细胞糖酵解及氧化磷酸化代谢能力同时增强。此外，我们发现在分化过程中，鼠足细胞主要能量来源从糖酵解转变为线粒体氧化磷酸化。

Imasawa等[5]的研究观察了高糖对足细胞代谢的影响。在高糖刺激下，线粒体供能比显著下调，同时糖酵解供能占比显著升高。其蛋白质组学结果也表明，高糖条件下三羧酸循环相关蛋白以及线粒体呼吸链蛋白表达显著下调，而糖酵解代谢酶表达显著升高[5]。而Abe等[7]在TGF-β刺激足细胞损伤的体外模型中发现，TGF-β可以通过激活线粒体氧化磷酸化，刺激ROS产生，从而介导足细胞损伤。2017年，Qi等[8]通过蛋白质组学比较糖尿病患者未发生肾脏疾病(保护组)和累及肾脏损伤(非保护组)的肾组织样本发现，保护组肾小球内14种葡萄糖代谢相关酶显著升高，其中丙酮酸激酶M2(PKM2)-糖酵解限速酶-表达水平和酶活性均上调。而在高糖诱导的体外损伤模型中，足细胞中丙酮酸激酶活性明显降低。同时，足细胞特异敲除PKM2的小鼠在构建链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型后，肾组织损伤明显加重，系膜增生程度和尿白蛋白明显高于对照组。这些结果表明PKM2表达升高对肾组织有保护作用。同时，该作者进一步发现小分子PKM2激动剂可逆转高血糖诱导的毒性葡萄糖代谢产物的累积，提高糖酵解能力，同时促进线粒体生物合成和线粒体融合。提示PKM2的激活可通过促进糖酵解和线粒体功能以保护肾脏[8]。以上结果表明，在不同刺激下，足细胞的代谢模式不尽相同，这种代谢模式的改变可能参与足细胞损伤。

2019年Huber团队研究发现，与小管相比，肾小球中三羧酸循环的代谢中间产物相对较少，电镜显示足细胞胞内线粒体密度较低。原代足细胞结果显示，生理条件下足细胞内ATP主要来源于糖酵解而不是线粒体。为了进一步证实这一观点，作者在足细胞上特异性的敲除了线粒体上的三种蛋白，包括参与线粒体分裂的蛋白1(DRP1)、参与线粒体生物合成蛋白(PGC-1a),以及线粒体转录因子(TFAM)。尽管足细胞上这些蛋白的缺失对线粒体产能有一定影响，但是足细胞结构与功能并没有任何改变。因此，作者认为足细胞主要依赖糖酵解供能，线粒体氧化磷酸化对足细胞ATP合成的贡献非常有限[9]。

尽管到目前为止，线粒体疾病被归因于氧化磷酸化损伤，但是近年来，有越来越多的研究表明，线粒体损伤导致的能量不足并不是引起足细胞损伤的主要原因，而其介导的信号通路紊乱可能是更重要的因素。其中典型的例子就是线粒体12S rRNA 高甲基化导致的线粒体电子传递链功能障碍以及细胞凋亡的发生。由于线粒体功能障碍导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)增多，进而激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路，介导E2F1依赖性凋亡信号通路的活化。体内外阻断或者敲除AMPK信号通路都能抑制细胞凋亡，尽管仍存在呼吸链损伤导致的能量不足，这些结果提示线粒体介导的信号通路紊乱在细胞损伤中的重要性[10]。结合Huber的研究结果，该现象解释了足细胞对于线粒体的结构和功能的依赖性独立于线粒体氧化磷酸化供能。

线粒体功能障碍与足细胞损伤

线粒体基因及相关蛋白异常参与足细胞损伤局灶节段性肾小球硬化(FSGS)被认为是一种足细胞疾病，由足细胞裂孔隔膜相关蛋白或者锚定蛋白突变引起。患者肾组织切片电镜结果显示足突融合，损伤的线粒体在足细胞内聚集，提示线粒体基因突变将导致足细胞损伤。为了验证这一现象，有研究人员在小鼠mtDNA基因组中诱发突变，发现突变小鼠表现出严重的肾脏损伤[11]。但是，究竟是ATP产能的下调、还是ROS产生增多亦或其他线粒体相关的损伤因素导致的足细胞损伤目前仍不清楚。

辅酶Q10(CoQ10)作为从复合物Ⅰ 、Ⅱ 到复合物 Ⅲ 的电子穿梭体，对线粒体电子传递至关重要。CoQ2、CoQ6 和癸二烯基二磷酸合成酶亚基2(PDSS2)均为CoQ10生物合成所需的酶。报道显示，CoQ2、CoQ6和PDSS2[12]突变可能是FSGS发生的潜在始动因素。这些病例显示足细胞足突缺失,胞体内出现同质异形的线粒体。同样，足细胞损伤可能是由于能量供应不足或者ROS产生增多所致[13]。为了研究线粒体功能障碍对足细胞的直接影响，Peng等人发现，在足细胞中特异性敲除Pdss2的CoQ缺陷小鼠足突消失,同时出现蛋白尿。

ADCK-线粒体呼吸链蛋白，参与CoQ的生物合成。足细胞特异敲除Adck4可以抑制细胞迁移，同时加重斑马鱼肾脏损伤[14]。Yamagata等[15]报道显示，59%FSGS患者肾脏mtDNA拷贝数减少，同时利用原位PCR技术发现，突变的mtDNA在足细胞积聚，而肾小管上皮细胞中仍是正常的mtDNA。该研究亦是首次报道足细胞线粒体基因突变可以导致肾小球疾病的发生。Mpv17位于足细胞线粒体内膜，在肾小球损伤动物模型及FSGS中表达下调。肾毒血清肾炎模型中，Mpv17-/-敲除小鼠蛋白尿显著高于对照。体外鼠足细胞系研究显示，敲除Mpv17的足细胞凋亡易感性增加，ROS增多，线粒体功能下降，mtDNA拷贝数减少，细胞结构改变[16]。

线粒体动力学异常参与足细胞损伤线粒体是可塑性较高的细胞器，通过融合和裂变不断的改变自身的形态和大小，以适应胞内环境变化，这一过程又称线粒体动力学。线粒体的融合与裂变决定了线粒体的长度及其网络结构。此外，融合与裂变对于线粒体的生长和再分布非常重要。

线粒体裂变主要受线粒体相关动力蛋白(dynamin-related protein 1，DRP1)调控。在裂变过程中，DRP1被招募到线粒体外膜上，在膜周形成环状低聚物。该作用在DRP1受体，包括线粒体接头裂变蛋白1(FIS1)、线粒体分裂因子(MFF)、线粒体动力学蛋白49 kD/51 kD(MiD49/51)的协同作用下增强。DRP1的翻译后修饰对于其向线粒体的迁移具有十分重要的调节作用。一系列激酶通过磷酸化DRP1两个保守的丝氨酸位点从而影响其亚细胞定位。高糖刺激下，Ser637/656 两个位点被磷酸化促进线粒体裂变[17]。此外，Ca2+/ CaMKIa能磷酸化相同的位点促进DRP1向线粒体聚集[18]。相反地，蛋白激酶PKA通过磷酸化Ser600抑制DRP1活性[19]。

线粒体融合分为外膜融合和内膜融合两步，外膜的融合主要由线粒体融合蛋白1(MFN1)和MFN2形成同源或异源二聚体来调节。视神经萎缩因子1(OPA1)参与内膜的融合以及线粒体嵴的稳定，线粒体膜电位通过调节OPA1的翻译后修饰在内膜融合中发挥重要作用。

有研究表明，足细胞线粒体碎片化加重了糖尿病肾病小鼠的肾脏损伤。相反，足细胞特异性敲除DRP1后，db/db小鼠蛋白尿下降、系膜基质沉积减少、足突融合减轻。同样，体外敲除DRP1的足细胞线粒体变长，高糖刺激下氧耗率与对照无显著差异。而DRP1的抑制剂Mdivi-1能够通过稳定线粒体形态，抑制糖尿病肾病进展[17]。

线粒体合成障碍参与足细胞损伤线粒体参与细胞内一系列生物学过程，细胞可以通过调节线粒体生物合成和功能来适应自身的代谢及能量需求。线粒体生物合成受到一系列转录因子调控。

PGC1转录共激活因子家族(PGC-1a、PGC-1b、PRC)是调节线粒体生物合成的主要因子。PGC-1a不与 DNA 直接结合，而是与结合在反应元件上的转录因子相互作用，从而发挥其对线粒体功能的调节作用，包括线粒体生物合成、脂肪酸b氧化、三羧酸循环以及氧化磷酸化等。PGC-1a参与介导阿霉素引起的足细胞损伤。阿霉素属于蒽环类抗生素，主要通过抑制拓扑异构酶干扰DNA的组装，常用于治疗肿瘤。阿霉素通过抑制足细胞PGC-1a的表达，从而促进线粒体ROS产生、下调mtDNA拷贝数、减少ATP产生。足细胞过表达PGC-1a能显著抑制阿霉素诱导的线粒体功能紊乱及足细胞凋亡[20]。

NAD+依赖性的组蛋白去乙酰化酶SIRT1-7家族也参与调节线粒体生物合成，在肾脏疾病中发挥重要作用。研究显示，SIRT1使PGC-1 a去乙酰化，从而减轻醛固酮诱导的足细胞损伤，而白藜芦醇可以激活SIRT1，发挥肾脏保护作用[21]。

线粒体氧化应激参与足细胞损伤ROS来源于氧气，容易氧化其他分子。低水平的ROS促进应激状态下细胞增殖及存活，但是高水平的ROS具有致病性。

大量研究表明，不管是模型动物还是肾病患者，肾脏内ROS含量均显著增多。自由基理论认为，糖尿病微血管并发症的发生是由于线粒体ROS产生增多导致线粒体功能异常，最终导致细胞损伤及肾脏疾病进展。体内外研究表明，高糖通过诱导ROS的产生促进足细胞凋亡和丢失[22]。糖尿病小鼠给予线粒体抗氧化剂mitoTEMPO能显著减轻肾脏损伤。运用超氧化物阴离子荧光探针检测发现mitoTEMPO可以减少糖尿病小鼠线粒体内ROS含量[23]。

尽管对线粒体ROS是否对细胞有害这一观点仍存在争议，但是可以确定的是线粒体内ROS含量升高可以通过多种途径损伤细胞，如损伤核及线粒体DNA，促进细胞凋亡等。越来越多的研究发现，线粒体ROS产生过多或者过少都会影响细胞的正常功能。当线粒体ROS水平较低时，会影响一些氧化还原依赖蛋白的正常功能和活性，导致相关信号通路的紊乱[24]。

新型线粒体靶向药物治疗足细胞病

SS-31 Arg-2,6-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2 (SS-31)是靶向于线粒体内膜的四肽，集中于线粒体内膜，不会导致线粒体去极化。最初研究认为这些肽为线粒体靶向抗氧化剂。随着研究深入发现，这些肽能选择性地与线粒体内膜上的心磷脂相互作用，稳定线粒体嵴。在急性肾损伤模型中，SS-31得到广泛研究。大鼠缺血再灌注模型中，SS-31能通过加快线粒体产能的恢复在再灌注早期维持线粒体结构与功能[25]。同时，SS-31能够抑制心磷脂氧化，抑制线粒体肿胀，从而在缺血再灌注模型中维持线粒体嵴的结构[26]。近期研究显示，大鼠肾脏缺血45 min后足细胞肿胀，足突消失。缺血1个月后给予SS-31干预1.5个月。在缺血9个月后发现，短暂的SS-31干预能恢复足突结构，缓解肾脏损伤[27]。给予24月龄小鼠随机接受8周SS-31或者生理盐水干预,在26月龄比较其线粒体形态以及肾小球硬化程度。结果显示，SS-31能够有效减少衰老相关指标P16表达，增加壁层上皮细胞密度，尽管不影响足细胞数量，但可减少足细胞损伤标志物Desmin的表达，改善足细胞骨架完整性[28]。因此，即使在老年小鼠中开始治疗，短疗程的SS-31对肾小球线粒体仍具有保护作用。

MitoQ,MitoTEMPO,SKQR1 MitoQ、MitoTEMPO和SKQR1属于线粒体靶向的抗氧化剂，这些抗氧化剂带正电荷，使其以电位依赖性方式转运至线粒体基质中。嘌呤霉素诱导的大鼠微小病变肾病模型中，MitoTEMPO能显著抑制嘌呤霉素诱导的尿蛋白排泄率，缓解肾小球脂质过氧化，减轻足细胞线粒体损伤[29]。缺血再灌注前给予SKQR1预处理能减少组织ROS产生及脂质过氧化反应，改善肾功能，但术后给药却无肾脏保护作用[30]。此外，在LPS诱导的脓毒血症模型中MitoQ通过增加线粒体膜电位改善肾脏功能[31]。还有证据表明MitoTEMPO在脓毒症模型中通过提高线粒体复合物活性改善肾功能[32]。

线粒体糖醛酸(MA-5)MA-5属于最新一类线粒体靶向药物。它是植物激素吲哚-3-乙酸的衍生物，在筛选能增加细胞ATP含量的化合物时发现。MA-5能够增加细胞ATP并改善遗传性线粒体疾病患者成纤维细胞的存活率。目前MA-5 的作用机制仍不清楚。据报道，它增加 ATP 合成的途径独立于电子传递或氧化磷酸化。研究表明MA-5靶向线粒体嵴连接处的线粒体蛋白 mitofilin/Mic60，有利于 ATP 合成酶的寡聚化和超复合物的形成[33]。目前需要更多的研究来充分了解MA-5与 mitofilin/Mic60 之间的相互作用如何通过改善细胞能量代谢保护肾脏。

小结：线粒体的结构和功能的稳定对于足细胞来说至关重要。足细胞线粒体损伤参与多种获得性或者遗传性肾小球疾病的发生发展。进一步了解足细胞能量代谢调控以及线粒体损伤对足细胞结构和功能的影响，可以为肾小球疾病的治疗提供新的靶点。