LncRNA GAS5通过miR-21/ADAMTS-1途径抑制大鼠肺纤维化

刘理静,钱 红,王 乐,胡 柯, 贺兼斌, 田玉梅

(1. 湖南医药学院护理学院，湖南 怀化 418000；2. 长沙民政职业技术学院医学院，湖南 长沙 410004；3. 湖南医药学院医学院，4. 湖南医药学院侗医药研究湖南省重点实验室，5. 怀化市第一人民医院呼吸与危重症医学科，湖南 怀化 418000)

肺纤维化是一种难治性、致死性疾病，以Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ，Col Ⅰ)和Ⅲ型胶原(collagen type Ⅲ，Col Ⅲ)等细胞外基质成分在肺间质过度蓄积为特征[1-2]，因此，积极寻找调控Col Ⅰ、Col Ⅲ合成与分解代谢平衡的机制对于肺纤维化的防治具有重要价值。Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-1(a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif，ADAMTS-1)是降解Col Ⅰ和Col Ⅲ最重要的酶，有较强的抗肺纤维化作用[3-4]。本课题组前期研究表明，miR-21通过靶向沉默ADAMTS-1，促进肺成纤维细胞Col Ⅰ和Col Ⅲ合成，从而加重大鼠肺纤维化病变[4-5]。长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一类非编码 RNA分子，长度超过200 个核苷酸，不具有蛋白编码功能。近年研究发现，lncRNAs能够作为竞争性内源 RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)吸附miRNAs，上调miRNAs的靶基因表达，发挥生物学功能[6-7]。生长阻滞特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5)是一种全长为630个核苷酸的lncRNA，与肝、肾纤维化相关[8-9]，但在肺纤维化中的作用有待阐明。我们前期通过生物信息学分析发现，GAS5与ADAMTS-1分享一个相同的miR-21 结合位点，表明3种RNA之间可能存在ceRNA调控模式。为此，本研究通过建立SD大鼠肺纤维化模型，探讨GAS5对肺纤维化的影响及miR-21/ADAMTS-1途径在其中的作用，旨在为这种难治性疾病的防治提供新靶点和理论与实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞株购于中国科学院上海细胞库；美国Gibco公司提供胎牛血清(10099141)和DMEM高糖培养基(11965084)；pGL3载体(E1751)、脂质体3000转染试剂(lipofectamineTM3000，L3000015)分别购自美国Promega公司、Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012)为上海碧云天生物技术有限公司产品；雄性3-4月龄无特定病原体级健康SD大鼠30只，体质量(220.0±7.2)g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2014-0011；博莱霉素A5(批号：180901)购自天津太河制药有限公司；GAS5过表达慢病毒载体(LV-GAS5)购于上海闪晶分子生物科技有限公司；广州锐博公司提供miR-21激动剂(agomir)、miR-21 模拟物(mimic)及模拟物阴性对照物(Mimic-NC)；Ⅰ型前胶原羧基端前肽(procollagen type I carboxyterminal propeptide，PICP，ER0322)和Ⅲ 型前胶原氨基端前肽(procollagen type Ⅲ aminoterminal propeptide，PⅢNP，ER1221)的酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒为武汉菲恩生物科技有限公司产品；逆转录试剂盒(A5001)、SYBR® Green Real Time PCR Master Mix(QPK-201)、RIPA 裂解液(R0010)分别由美国Promega公司、日本 Toyobo公司、北京索莱宝科技有限公司提供；PVDF膜(T2234)和TRIzol试剂(15596026)为美国Invitrogen公司产品；兔抗大鼠ADAMTS-1(ab39194)、Col Ⅰ(ab34710)、Col Ⅲ(ab7778)、β-actin(ab8227)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(ab205718)购于英国Abcam公司。

1.2 仪器细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；轮转式石蜡切片机(德国徕卡公司)；680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；LightCycler 480实时荧光定量PCR仪(美国Roche公司)；电泳仪和转膜仪(美国Bio-Rad公司)；化学发光凝胶成像分析仪(美国UVP公司)。

1.3 生物信息学预测利用Targetscan(http://www.targetscan. org/)、lnCeDB(http://gyanxet-beta.com/ lncedb/)、 PicTar(http://www.pictar.org/)等在线软件预测GAS5、miR-21、ADAMTS-1 3′-非翻译区(3′-untranslated region, 3′-UTR)之间的靶向结合情况。

1.4 荧光素酶活性检测HEK293T细胞用含100 g·L-1胎牛血清的DMEM高糖培养液，于37 ℃，50 g·L-1CO2、饱和湿度条件下培养、传代，实验用对数生长期细胞。查找GAS5基因序列并通过PCR进行扩增，将扩增产物插入荧光素酶报告载体pGL3，构建野生型GAS5载体(GAS5-WT)，同时对GAS5序列中与miR-21结合的位点进行CTGGA到CCTTA的点突变，构建突变载体(GAS5-Mut)，按照操作说明使用lipofectamineTM3000，将以上质粒与miR-21 mimic或Mimic-NC共转染HEK293T细胞48 h，利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组细胞荧光素酶活性。实验重复3次。

1.5 大鼠肺纤维化模型的制备与处理♂健康SD大鼠30只，于无特定病原体环境中适应性饲养1周后，按随机数字表法将其分为3组：对照组、LV-GAS5组和LV-GAS5+miR-21 agomir组，每组包含10只动物。然后按照课题组前期报道的方法建模[5]，即利用3 mL·kg-1的100 g·L-1水合氯醛向大鼠腹腔内注射，充分麻醉大鼠后切开颈正中位置，使气管暴露，再将溶解了博莱霉素A5(5 mg·kg-1)的生理盐水0.2 mL一次性向气管内注入，然后迅速直立并旋转大鼠，以使药液均匀地分布于肺内，构建大鼠肺纤维化模型。给药后次日(d 1)，LV-GAS5组大鼠尾静脉注射0.2 mL含有1×1014TU·L-1的GAS5过表达慢病毒载体，LV-GAS5+miR-21 agomir组大鼠予相同体积的GAS5过表达慢病毒载体(1×1014TU·L-1)和miR-21 agomir(10 mg·kg-1)，而对照组大鼠尾静脉注射0.2 mL的PBS，每2周注射1次，共2次。 d 28，麻醉大鼠后开胸，采集3 mL血液，以3 000 r·min-1离心10 min(离心半径15 cm)，提取上层血清，置入-20 ℃冰箱保存，用于检测PICP和PⅢNP浓度。然后，处死大鼠，截取右肺组织，-70 ℃冻存，以备荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和Western blot检测；再用0.1 mol·L-1中性缓和福尔马林经主支气管注入左肺内，充分展开胸膜后，投入0.1 mol·L-1中性福尔马林中固定1 d以上，再石蜡包埋后，5 μm厚度切片，病理组织学检查。

1.6 肺组织病理学检查将左肺石蜡切片行HE染色和Masson 染色，在光镜下利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件观察肺组织病理学改变。评定方法参照文献[3,10]，肺组织肺泡炎症程度评定使用HE染色：无肺组织炎，评为0分；肺组织炎的面积<20%，评为1分；肺组织炎的面积20%-50%，评为2分；肺组织炎的面积>50%，评为3分。肺组织纤维化程度评定使用Masson染色：无肺纤维化，评为0分；肺纤维化面积<20%，评为1分；肺纤维化面积在20%-50%，评为2分；肺纤维化面积>50%，评为3分。

1.7 酶联免疫吸附法检测血清PICP和PⅢNP浓度使用双抗体夹心ELISA对各组大鼠血清PICP和PⅢNP浓度进行检测，由专人严格按试剂盒提供的操作步骤进行。

1.8 qRT-PCR检测GAS5、miR-21、ADAMTS-1表达收集各组大鼠右肺组织样本，利用TRIzol试剂提取样本中总RNA，再将提取的RNA通过逆转录试剂盒反转录成cDNA。然后行PCR扩增，所用引物由上海生工生物工程公司按照Tab 1所示序列合成。利用SYBR® Green Real Time PCR Master Mix，在Roche 480实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应，反应条件： 95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 sec，62 ℃退火20 sec，72 ℃延伸15 sec，总共40个循环。用ΔΔCt值法，以U6、GAPDH为内参照分别定量miR-21、GAS5和ADAMTS-1表达。

Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.9 Western blot检测ADAMTS-1、Col Ⅰ和Col Ⅲ表达利用RIPA蛋白裂解液从各组大鼠右肺组织样本中提取蛋白质，BCA法对蛋白样品浓度进行测定。然后上样、电泳并转PVDF膜，予50 g·L-1脱脂牛奶室温下封闭4 h，再分别滴加兔抗大鼠ADAMTS-1(1 ∶1 000)、Col Ⅰ(1 ∶1 000)、Col Ⅲ(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶3 000)二抗，在37 ℃条件下孵育60 min，然后行ECL显色，并于暗室内曝光。通过凝胶图像分析系统(Labwork软件)扫描所得胶片，用β-actin为内参照对ADAMTS-1、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达进行定量。

2 结果

2.1 鉴定GAS5、miR-21、ADAMTS-1间的ceRNA调控模式生物信息学预测发现(Fig 1)，GAS5与ADAMTS-1具有一个相同的miR-21 结合位点(GACC，即红色框与蓝色框重叠的部分)。而且，荧光素酶报告基因显示(Fig 2)，miR-21 mimic不影响突变型GAS5荧光素酶活性(P>0.05)，但明显减少野生型GAS5荧光素酶活性(P<0.01)，进一步表明GAS5能够靶向结合miR-21。结合课题组前期研究已经鉴定ADAMTS-1为miR-21的靶基因，可确定GAS5、miR-21、ADAMTS-1之间存在ceRNA调控模式。

Fig 1 Binding sites among GAS5, ADAMTS-1 and miR-21 predicted by bioinformatics

Fig 2 Comparison of luciferase activity among groups n=3)

2.2 各组大鼠肺组织GAS5表达实验过程中，各组大鼠均未出现死亡。实验结束后，处死大鼠，提取右肺组织，利用qRT-PCR检测GAS5表达水平，结果显示(Fig 3)，相对于对照组，LV-GAS5组和LV-GAS5+miR-21 agomir组GAS5表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，提示构建的GAS5过表达慢病毒载体具有较高的感染效率。

Fig 3 Comparison of GAS5 expression in pulmonary tissues among groups n=10)

2.3 GAS5减轻肺纤维化大鼠肺组织病理改变采用HE染色(Fig 4)和Masson染色(Fig 5)观察各组大鼠肺组织病理改变，发现对照组大鼠肺组织中有大量的炎性细胞浸润及成纤维细胞增生，肺泡间隔显著增厚，部分肺泡腔被纤维组织占据，肺泡壁被破坏，大量蓝色胶原沉积于肺间质内，纤维化明显；LV-GAS5组上述病理改变明显减轻，而LV-GAS5+miR-21 agomir组病理改变较LV-GAS5组加重。定量分析显示(Tab 2)，LV-GAS5组肺泡炎与肺纤维化程度评分相比于对照组均降低(P<0.01)，然而，与LV-GAS5组比较，LV-GAS5+miR-21 agomir组上述评分明显升高(P<0.01)。

Fig 4 The morphological changes of pulmonary tissues among groups (HE×200, scale bar = 100 μm)

Fig 5 The collagen deposition of pulmonary tissues among groups (Masson×200, scale bar=100 μm)

Tab 2 Effect of GAS5 on pathological changes of pulmonary tissues from pulmonary fibrosis rats n=10)

2.4 GAS5降低肺纤维化大鼠血清PICP和PⅢNP水平利用ELISA检测各组大鼠血清PICP、PⅢNP水平，结果显示(Tab 3)，LV-GAS5组血清PICP、PⅢNP水平较对照组降低(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir组血清PICP、PⅢNP水平高于LV-GAS5组(P<0.01)。

Tab 3 Comparison of serum PICP and PⅢNP levels among groups n=10)

2.5 GAS5下调肺纤维化大鼠肺组织Col Ⅰ、Col Ⅲ表达Col Ⅰ、Col Ⅲ分别为PICP、PⅢNP的成熟体，为了进一步阐明GAS5 对肺纤维化大鼠肺组织中胶原蓄积的影响，采用Western blot检测各组大鼠肺组织Col Ⅰ和Col Ⅲ表达。如Fig 6所示，LV-GAS5组Col Ⅰ和Col Ⅲ表达较对照组下调(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir组Col Ⅰ和Col Ⅲ表达则明显高于LV-GAS5组(P<0.01)，与血清PICP、PⅢNP水平变化一致。

Fig 6 Comparison of Col Ⅰ and Col Ⅲ expression in pulmonary tissues among groups n=10)

2.6 GAS5增加肺纤维化大鼠肺组织ADAMTS-1表达ADAMTS-1是降解Col Ⅰ、Col Ⅲ最重要的酶，且已经被鉴定为miR-21的靶基因，为了揭示GAS5抑制Col Ⅰ、Col Ⅲ表达的机制，通过qRT-PCR、Western blot分别检测各组大鼠肺组织ADAMTS-1 mRNA与蛋白表达(Fig 7)，发现LV-GAS5组ADAMTS-1 mRNA与蛋白水平较对照组明显升高(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir组ADAMTS-1 mRNA与蛋白水平较LV-GAS5组降低(P<0.01)，提示ADAMTS-1介导GAS5对Col Ⅰ、Col Ⅲ表达的抑制作用。

2.7 GAS5降低肺纤维化大鼠肺组织miR-21表达通过qRT-PCR检测各组大鼠肺组织miR-21表达(Fig 8)，发现LV-GAS5组miR-21水平明显低于对照组(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir组miR-21水平较LV-GAS5组显著增加(P<0.01)。

3 讨论

肺纤维化为一种死亡率极高的呼吸系统疾病，是各种不同病因所致的肺间质疾病的共同结局，以肺泡间质炎性细胞浸润、纤维母细胞增生和大量胶原沉积为特征，目前尚无有效的治疗方法，严重危害人类健康。因此，以肺纤维化发病机理中的关键环节为突破口，开发靶向治疗新药对于改善患者预后具有十分重要的意义。GAS5是一种全长为630个核苷酸的lncRNA，定位于人1q25.1的小开放阅读框。以往的研究多关注GAS5在肿瘤增殖、侵袭和转移等方面的作用[11-12]，新近研究表明，GAS5也与纤维化疾病相关[8-9]，但在肺纤维化中的作用尚不清楚。本研究发现，GAS5过表达减轻大鼠肺纤维化病变，并降低血清PICP、PⅢNP水平，下调肺组织Col Ⅰ和Col Ⅲ表达，提示GAS5能够促进Col Ⅰ和Col Ⅲ降解，发挥抗肺纤维化作用。

Fig 7 Comparison of ADAMTS-1 mRNA (A) and protein (B) expression in pulmonary tissues

Fig 8 Comparison of miR-21 expression in pulmonary tissues

LncRNA可作ceRNA 通过miRNA 应答元件与靶mRNA竞争性结合同种 miRNA分子，使miRNA 的水平下降，抑制 miRNA 对靶 mRNA 的沉默效应，进而上调靶基因的表达[6-7]。ceRNA是广泛存在于动物体内的一种全新的基因表达调控模式，ceRNA调控网络失调与肺纤维化的发生发展关系密切[13-14]。本研究中，GAS5与ADAMTS-1 3′-UTR分享一个共同的miR-21结合位点，而且miR-21模拟物明显减少野生型GAS5荧光素酶活性，但对突变型GAS5荧光素酶活性无明显影响，从而证实GAS5为miR-21的靶基因。同时，课题组前期研究已经鉴定ADAMTS-1为miR-21的靶基因[4-5]。因此，GAS5、miR-21、ADAMTS-1间存在ceRNA调控模式，这为探讨GAS5促进Col Ⅰ和Col Ⅲ分解机制提供了新的方向。

miRNAs是一类在人体广泛分布的内源性非编码RNA，长度为19-25个核苷酸，在转录后水平抑制靶基因表达。miR-21定位于人17q23.2的脆性区域上，有促纤维化作用[15-16]。ADAMTS-1属于一种Zn2+依赖的分泌型蛋白，是ADAMTS家族中第一个被发现的成员，分泌后经含 TSP-1 的血小板反应素同源域锚定于细胞外基质，通过金属蛋白酶结构域分解Col Ⅰ和Col Ⅲ 等细胞外基质成分[17]。研究发现，miR-21过表达能明显下调ADAMTS-1水平，进而增加肺组织Col Ⅰ和Col Ⅲ含量，从而加重博莱霉素所致的小鼠肺纤维化[18]。本研究发现，GAS5过表达降低miR-21水平，上调ADAMTS-1表达，而且miR-21 agomir处理可逆转GAS5过表达对ADAMTS-1、Col Ⅰ、Col Ⅲ表达及肺纤维化病变的影响。因此，miR-21/ADAMTS-1途径在GAS5抑制大鼠肺纤维化过程中发挥关键作用。

综上所述，本研究结果表明，GAS5作为ceRNA吸附miR-21，上调ADAMTS-1表达，促进Col Ⅰ、Col Ⅲ降解，从而抑制博莱霉素所致的大鼠肺纤维化。随着研究的深入，促进内源性GAS5表达可能是防治肺纤维化的新策略。

(致谢：本实验在侗医药研究湖南省重点实验室和怀化市第一人民医院医学中心实验室完成，感谢各位同事和老师的帮助及指导。)