基于网络药理学探究补阳还五汤防治动脉粥样硬化的作用机制

魏亚男，朱博冉，姬梦姣，周 童，翟 意，薛文达，陶伟伟，陈 刚，王 薇，吴颢昕

(1.南京中医药大学中医学院,中西医结合学院中医脑病重点实验室，南京 210023；2.暨南大学中医学院脑病个性化防治跨学科研究所，广州 510632；3. 南京中医药大学医学院整合医学院，南京 210023)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性动脉壁疾病，涉及泡沫细胞的产生，细胞外脂质的积累，斑块的形成以及最终斑块的破裂[1]。当今，动脉粥样硬化性心血管疾病是主要的死亡原因[2]。基于他汀类药物的一系列不良反应[3]，开发更有效的治疗策略以改善AS患者的根治性治疗并减少副作用的发生意义重大。补阳还五汤出自清代名医张锡纯的《医林改错》，由黄芪、川芎、当归、赤芍、桃仁、红花、地龙等7味中药组成,是补气活血的代表方剂。现代药理研究发现补阳还五汤具有抑制炎症反应,降低血脂,稳定动脉斑块的作用[4]。董捷鸣等建立了补阳还五汤HPLC指纹图谱,标记了23个共有峰[5]，初步探索了该配方的生物活性成分。但对于多成分多靶点的补阳还五汤在防治AS的复杂机制方面研究并没有结束。

随着计算机技术与数据库技术的不断成熟，中药系统药理学分析平台以中医药大数据为基础，通过网络药理学构建的各种复杂成分的分子网络以及基于多级靶标的蛋白质和基因相互作用，可以阐释其物质基础和功能[6]。中医方剂的网络药理学分析正成为研究由高脂血症和AS等复杂多样的因素表现出来的疾病的一种重要研究方法。利用中药系统药理学分析平台探究补阳还五汤治疗AS的作用机制,首先有利于解决物质基础筛选时造成的高昂的成本及长周期的问题,其次也有助于解决探寻补阳还五汤防治机制时出现的单靶作用局限性问题。

1 材料

1.1 补阳还五汤的化学成分来源补阳还五汤各中药的化学成分收集自中药系统药理学分析平台数据库(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，TCMSP收录了大量中草药数据，对每种药物的成分、分子名称、分子量、人类口服生物利用度(OB)、类药性(DL)、半衰期和血脑屏障等进行了描述。由于目前TCMSP数据库中暂未收录地龙的成分，因此我们从TCMID (http://bidd.nus.edu.sg/group/tcmsite/query.aspx)数据库收集地龙的化学成分。设定OB≥30% 和 DL≥0.18，筛选出符合条件的化合物进行分析。但由于这种筛选剔除了很多不符合条件的但却有广泛药理学作用的化合物，如黄芪甲苷、阿魏酸、红花黄色素等。为了提高预测结果可信度，进一步通过相关文献收集补阳还五汤的化学成分。并利用 Pub Chem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)确证其分子结构及名称，保存其sdf 格式，建立补阳还五汤的化合物数据库。

1.2 化合物靶点的筛选通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)，基于 Drug Bank 数据库，利用化学信息学对补阳还五汤所含药物靶标进行预测。检索补阳还五汤相关化合物，化合物对应的靶标，从而实现对补阳还五汤靶标信息的检索。经药典和文献查找TCMSP中未找到对应靶标的化合物，利用Pharm Mapper数据库进行预测。Pharm Mapper数据库(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php)是一种独特的生物信息学和化学信息资源相结合的药物靶标信息数据库，反向整合靶点和化合物。上传化学成分的sdf 格式至 Pharm Mapper 服务器平台，选择人类数据库，设置最终返回300个靶点，获得化合物预测靶点。通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)检索药物对应的靶标，实现对补阳还五汤靶标信息，包括Uniprot 蛋白数据库身份标识号(UniProt ID)，基因名称(Gene Name) 的确认，从而进行相关信息的进一步预测分析。

1.3 动脉粥样硬化靶标预测利用人类表型本体数据库 (HPO，https://hpo.jax.org/app/)检索AS相关靶标信息，包括Uniprot 蛋白数据库身份标识号(UniProt ID)，基因名称(Gene Name)。

1.4 网络构建和分析上传补阳还五汤与AS相关靶点至 STRING(https://string-db.org/)，筛选大于0.9的最高置信度的靶点信息。通过Cytoscape 3.6.1构建补阳还五汤靶点与AS基因靶点之间的互作网络。以“节点连接度(degree)”、“节点紧密度 (closeness) ”和“节点介度(betweenness) ”的中位数为卡值，选取同时符合 3个卡值的节点作为补阳还五汤防治AS网络的核心靶点。并使用插件MCODE对核心靶点互作网络进行聚类分析，以degree cutoff=2，node score utoff=0.2，K-score=5，max deapth=100为筛选标准。

1.5 挖掘基因功能以及相关通路整合上述相关数据库得到靶标基因，运用注释、可视化和集成发现数据库6.8(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)在线工具，针对补阳还五汤治疗AS的核心靶标进行KEGG通路以及GO生物过程、细胞组成、和分子功能富集分析。以FDR<0.05作为筛选标准，得到补阳还五汤治疗AS的关键作用信号通路,并构建“补阳还五汤-中药-化学成分-核心靶点-关键通路”的可视化网络。

2 结果

2.1 补阳还五汤中所含药物的成分组成基本信息及药物间共有靶标分析利用 TCMSP，以及通过相关文献搜索，得到补阳还五汤所含中药基本信息(Tab 1) 。

Tab 1 Information of ingredients in Buyang Huanwu decoction and their putative targets

通过TCMSP以及相关文献搜索，得到补阳还五汤中各单味药化学成分共计140 个，预测靶标174个，并对其中的共有靶标进行分析(Tab 2) 。其中黄芪与赤芍、黄芪与红花的共有靶标分别为 93、97个，红花与赤芍、红花与川芎的共有靶标分别为99、95个，协作关系最密切，可能是治疗AS的重要药对。

Tab 2 Common targets between every two herbs in Buyang Huanwu decoction

2.2 补阳还五汤化学成分靶标预测与分析通过 Cytoscape 3.6.1挖掘补阳还五汤 7种药物靶标与AS基因靶标之间的相互作用。根据 degree 值(Tab 3) 仅显示前10个靶点，推测补阳还五汤可能是通过调节MAPK1、PIK3R1、SRC、AKT1、APP、HRAS、JUN、TP53、EGF、RELA等关键基因来调节AS的发生与发展。

2.3 核心靶标网络通过Cytoscape 3.6.1对补阳还五汤调节AS的候选靶点建立互作网络，如Fig 1所示。根据 degree 值仅显示前 100 个靶点，图中节点的大小与degree值成正比关系。

Tab 3 Interaction between Buyang Huanwu decoction targets and atherosclerosis gene target

Fig 1 Core node interactional network between putative drug targets of Buyang Huanwu decoction and atherosclerosis targets

2.4 补阳还五汤防治AS关键靶标GO 和 KEGG 通路富集分析通过GO富集分析后发现，补阳还五汤的药物化学成分对应关键靶点参与了凋亡过程的负调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、以DNA为模板的转录、肽基丝氨酸磷酸化、肽基酪氨酸自磷酸化、胆固醇稳态、血管生成、对毒品的反应、细胞增殖调控、内皮细胞凋亡过程的负调控等生物过程和基因功能，对AS进行调节，其中FDR值较小的 20位，见Fig 2。

应用插件MCODE进行基因的聚类分析后发现，补阳还五汤的药物化学成分对应关键靶点参与脂质代谢、细胞凋亡等生物过程，对AS进行调节。对score>5的基因簇进行打分并排序，关键的靶点聚成3类,如Fig 3所示。

利用DAVID 6.8对各基因簇进行注释，筛选FDR<0.05的GO条目，其中基因簇1中相关基因主要参与脂质代谢相关的细胞组成与生物功能，基因簇3中相关基因与细胞凋亡的调控密切相关，而基因簇2中生物过程不满足筛选标准，结果见Tab 4。

Fig 3 Interaction module of modified Buyang Huanwu decoction combined with epimedium-AS-gene based on MCODE

Tab 4 Clustering analysis results of Buyang Huanwu decoction Network Nodes

KEGG 富集分析结果显示核心靶点与癌症、乙型肝炎、癌症中的蛋白聚糖通路以及炎症、免疫相关的T 细胞受体信号通路、PI3K-Akt 通路和FoxO信号通路密切相关。其中 FDR值较小的20位见Fig 4。

3 讨论

3.1 补阳还五汤药物成分分析补阳还五汤具有多成分、多靶点、调节方式多样的特点，在多味药作用叠加的基础上，补阳还五汤还会产生复杂的协同效应。黄芪、川芎、赤芍、红花等均为临床治疗AS使用频率较高的中药。红花与黄芪，红花与赤芍相互关联的成分最多。查阅文献发现，芍药中的芍药苷通过上调SIRT1增强自噬而减弱了ox-LDL诱导的凋亡和粘附分子表达[7]；黄芪和红花中的槲皮素可以抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成并延缓衰老[8]；山奈酚通过抑制TLR4 /NF-κB信号通路减轻ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡[9]。可以推测在防治AS方面红花和黄芪，红花和赤芍配伍可能具有一定的协同作用。

Fig 4 KEGG terms of candidate targets of Buyang Huanwu decoction against atherosclerosis

3.2 基因功能与相关通路分析KEGG通路分析表明癌症，乙型肝炎以及众多免疫和炎症通路可能是网络中重要的信号通路。癌症的研究是近些年来研究的热点，炎症、细胞增殖失调、氧化应激等条件易于发生AS，且利于不同类型的癌症的形成，用于治疗AS的他汀类药物差异性的调节单核细胞和巨噬细胞细胞因子可以用于癌症治疗[10]。核心靶点TP53、SRC、HRAS等肿瘤相关基因与乳腺癌、甲状腺癌、直肠癌密切相关[11]，这提示补阳还五汤的应用可能对癌症的防治具有重要意义。对LDL具有反应性的T细胞可以引发体液免疫反应，通过调节T 细胞受体信号通路可以降低血浆胆固醇和减少病变形成的抗动脉粥样硬化免疫反应[12]。

补阳还五汤的网络药理分析了7种草药，140种化合物和690种靶基因，并预测了174个核心靶基因和AS有关的主要通路和生物过程。MAPK1、PIK3R1、SRC、AKT1、APP、HRAS、JUN、TP53、EGF、RELA是网络中的主要靶基因。通过对补阳还五汤靶点互作网络进行聚类分析得出了3个显著性较强的基因簇。其中基因簇2中的生物过程FDR值>0.05，显著性最强的基因簇1包含了APP、VEGFA、APOA2、APOA1、APOB、APOE、APOA5、MAPK1等与脂质代谢相关的39个基因。在AS患者中，脂质代谢与多种生物过程和细胞组成相关，如胆固醇稳态，胆固醇外排，以及细胞外空间、乳糜微粒、超低密度脂蛋白颗粒等。APOA2、APOB、APOA1、APOE、APOA5是载脂蛋白家族重要成员，调控胆固醇的转运。当巨噬细胞在与低密度脂蛋白孵育期间积累大量胆固醇时，巨噬细胞不仅会在脂质小滴中储存过多的胆固醇，还会将过量的未酯化胆固醇沉积到巨噬细胞周围和下面的细胞外基质中[13]。MAPK1即ERK2，实验研究表明下调ERK1 / 2过表达可以抑制巨噬细胞/泡沫细胞的形成，并激活胆固醇逆向转运[14]；NF-κB家族的重要成员RELA即p65，已有研究发现补阳还五汤可能与抑制TLR4炎症通路包括NF-κB在内的主要元件有关[15]。最近的研究发现在低氧环境中，巨噬细胞诱导MAP激酶ERK1/2，参与激活NF-κB亚基p65，并通过诱导ATP结合盒转运蛋白A1和载脂蛋白A1基因促进胆固醇逆转运[16]。因此，我们推测补阳还五汤可以通过调节胆固醇代谢促进AS的治愈。基因簇3中基因参与对细胞凋亡的调控，细胞凋亡是对死亡信号的响应。研究表明补阳还五汤可能通过CDK5信号转导途径，下调caspase-3，Bax / Bcl-2抑制神经细胞凋亡[17]。调节细胞凋亡是补阳还五汤防治AS的重要途径，TP53(p53)是一种转录因子，参与外在的凋亡途径，或通过内在的线粒体途径调控凋亡小体的形成，进而促进胱天蛋白酶介导的凋亡[18]，补阳还五汤可能参与调控p53抗AS。

Fig 5 Multi-level network of Buyang Huanwu decoction, Chinese herbs, ingredients, critical targets and pathways

从多层次网络关系图(Fig 5)可以看出补阳还五汤多成分、多靶点、整体协同的抗AS作用。网络药理分析对进一步阐明其防治AS的物质基础，深入挖掘和开发经典名方补阳还五汤有重要意义。但本研究也存在一些缺陷，在利用TCMSP时无法考虑到方药组成用量、煎煮方药时可能发生的化学反应、药物体内代谢过程、而且不能预测尚未发现的抗AS机制、以及平台数据库的条件局限性问题。