胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白在蕈样肉芽肿患者中的表达情况及临床意义

王艳云，姚丽，王珊珊

郑州大学附属郑州中心医院皮肤科，郑州 450052

蕈样肉芽肿（mycosis fungoides，MF）是临床常见的皮肤恶性肿瘤，占所有皮肤肿瘤的50%[1]。MF分为斑片期、斑块期和肿瘤期3个时期[2]。斑块期和肿瘤期在临床上较容易被明确诊断，因为这两个时期的患者表现及组织病理学特征具有显著特点，临床诊断率高。而斑片期患者无显著临床症状，病理诊断结果也无特异性[3-4]。临床医师对MF早期的误诊率较高，斑片期肿瘤细胞数量较少，容易与其他皮肤疾病混淆，且尚无特异性诊断指标，对MF的早期诊断是一大难题。胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白（thymocyte selection associated high mobility group box protein，TOX）是一种高迁移率家族蛋白，其作用是对机体的染色体进行修饰[5]。研究报道，TOX几乎不在正常皮肤中表达，而在CD4+CD8+肿瘤细胞中高表达[6-7]。推测TOX也许能够作为MF的诊断指标。本研究采用免疫组织化学染色法检测TOX蛋白在MF和良性炎症性皮肤病患者中的表达情况，旨在探讨TOX蛋白在MF患者中的表达及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2020年1月于郑州大学附属郑州中心医院就诊的MF患者。纳入标准：①经病理学检查确诊为MF；②年龄＞18岁；③无其他皮肤疾病；④临床资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤、免疫系统疾病、结缔组织疾病等严重疾病；②入院前有相关治疗史。依据纳入和排除标准，本研究共纳入62例MF患者作为观察组，其中斑片期25例，斑块期24例，肿瘤期13例。斑片期患者中，男18例，女7例；平均年龄为（44.10±8.12）岁。斑块期患者中，男16例，女8例；平均年龄为（43.05±9.50）岁。肿瘤期患者中，男9例，女4例；平均年龄为（43.65±9.11）岁。斑片期、斑块期、肿瘤期患者的性别和年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。选取同期收治的良性炎症性皮肤病患者30例作为对照组，其中寻常型银屑病16例，慢性湿疹14例。观察组中，男43例，女19例；平均年龄为（43.35±7.88）岁。对照组中，男 17例，女 13例；平均年龄为（41.18±8.20）岁。两组患者的性别和年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 检测方法

采用免疫组织化学染色法检测两组患者中TOX蛋白的表达情况。收集两组患者的皮肤组织，常规制作石蜡组织切片。常规脱蜡和脱水，加入3%过氧化氢溶液，作用20 min以消除内源性过氧化物酶活性，加入0.01 mol/L、pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，滴加50 μl兔抗人TOX多克隆抗体（稀释比例为1∶100），于4℃摇床上孵育过夜，第2天洗板，再加入50 μl生物素化的羊抗兔二抗，室温下孵育1 h。加入辣根过氧化物酶标记的抗生蛋白链菌素，室温下孵育1 h；配制并加入0.04%的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液，显色5 min，并在显微镜下控制反应时间。依次进行苏木素复染、梯度乙醇脱水和中性树胶封片。采用磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照。

1.3 评价标准

由两名病理科医师采用双盲法判定染色结果。TOX蛋白阳性表达位于细胞核中，呈棕黄色或棕褐色颗粒。随机观察5个400倍视野，每个视野选择100个细胞，阳性细胞所占比例＜10%为阴性，≥10%为阳性[8]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用多因素方差分析；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者中TOX蛋白表达情况的比较

观察组患者中TOX蛋白的阳性表达率为91.94%（57/62），明显高于对照组的30.00%（9/30），差异有统计学意义（χ2=38.253，P＜0.01）。

2.2 不同分期MF患者中TOX蛋白表达情况的比较

斑片期、斑块期、肿瘤期MF患者中TOX蛋白的阳性表达率分别为80.00%（20/25）、100%（24/24）、100%（13/13），差异有统计学意义（χ2=6.298，P＜0.05）；但两两比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

TOX基因编码TOX蛋白，它是一种由一个氨基酸组成的DNA结合蛋白，它与双链DNA结合并使DNA解旋，充当转录因子，参与基因的转录调控[9]。TOX蛋白在所有脊椎动物中的结构都非常相似，并与多种肿瘤有关，如肺癌、乳腺癌、淋巴瘤和白血病[10-11]。TOX蛋白包含一个DNA结合域，该结构域可以通过修饰局部染色质的结构和调节各种蛋白质复合物来调节转录。尽管确切的机制尚不清楚，但研究表明TOX在胸腺细胞中的表达水平很高，离开胸腺并进入周围组织后，成熟的CD4+T细胞中TOX的表达水平很低[12-13]。

正常情况下，TOX蛋白在皮肤组织中不表达或表达水平很低，主要在淋巴组织和胃肠道腺细胞中表达[14]。胸腺中的TOX主要抑制CD4+前体细胞的降解，外周淋巴瘤中TOX mRNA和蛋白很少表达。研究表明，TOX基因在许多肿瘤中异常表达，如肺癌、乳腺癌和白血病[15-16]。另有研究表明，相对于良性炎症性皮肤病患者，MF患者中TOX基因呈高表达，并且随着疾病的发展，TOX基因的表达水平越来越高[17]。表明TOX基因异常表达可能与MF有关，但该研究结果仍有许多争议。

本研究探讨了TOX蛋白在MF患者中的表达情况及临床意义，结果表明，观察组中TOX蛋白的阳性表达率明显高于对照组，说明TOX可能参与了MF的发生和发展。有研究表明，TOX的过表达刺激了蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）的磷酸化，而AKT抑制剂能够抑制TOX引起的增殖促进作用[18]。推测TOX可能通过激活磷脂酰肌醇3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/AKT信号通路来促进细胞增殖和迁移。以上结果证实了TOX在MF患者中的过表达以及TOX与MF疾病进展的关系。此外，TOX可能成为MF诊断及治疗的重点靶基因。据报道，TOX可以诱导Myla细胞的增殖和迁移，通过干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制TOX还可减少Myla细胞的增殖和迁移[19]。

DNA异常甲基化时常导致肿瘤细胞增殖，诱发肿瘤产生，而且在肿瘤细胞中会进一步出现抑癌基因和凋亡基因的表达异常。在基因突变及抑癌基因失活中，DNA异常甲基化发挥了很大的作用。异常甲基化决定多种类型肿瘤的表观遗传特点。研究表明，TOX基因的甲基化水平在肺癌和乳腺癌患者中显著增加，基因决定蛋白表达，TOX蛋白通过促进细胞增殖和迁移而在MF中发挥致病作用[20]。在某些肿瘤患者中，出现TOX基因缺失的现象，基因缺失可使抑癌基因失活，从而使其不能对相关基因进行调节，影响了细胞的增殖等过程，破坏了细胞的稳定性。本研究结果显示，TOX蛋白在MF患者中的表达水平较高，说明TOX蛋白的表达出现了异常。

本研究结果还显示，斑片期MF患者中TOX蛋白的阳性表达率为80.00%，低于斑块期和肿瘤期MF患者的100%，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。分析原因可能是病例数较少。TOX蛋白在良性炎症性皮肤病组织中也出现阳性，说明TOX蛋白并不是肿瘤细胞特有的，可以推断阳性细胞的来源是淋巴细胞。然而某些炎症组织中TOX蛋白低表达和肿瘤细胞中TOX蛋白高表达的机制有待于进一步探讨。

目前对于MF的诊断尚无特异性方法，临床中面临许多困难，TOX蛋白在一些肿瘤患者的组织中呈高表达。本研究通过免疫组织化学染色法检测TOX蛋白的表达情况，结果发现TOX蛋白在MF患者中的表达水平较高，为临床诊断提供了参考，但缺乏有关其作用机制的研究，仍需进一步探讨。

综上所述，TOX蛋白在MF患者中的表达水平较高，可能在疾病进展中具有一定作用，值得进一步研究。