黄花倒水莲下调miR-369对LPS诱导大鼠心肌细胞损伤的保护机制研究

代 天 杨 萍 赵 谦 刘泰民 蒋 品 张苏川

(江汉大学附属医院(武汉市第六医院)心血管内科，武汉430015)

内毒素血症由内毒素感染引起，可导致致死性感染休克、多器官功能障碍或衰竭等，病死率极高[1]。心脏功能障碍是内毒素血症最常见的并发症，研究表明约40%的内毒素血症患者出现可逆性心肌抑制，而合并心肌功能障碍的患者病死率高达50%[2,3]。因此寻找有效的药物预防及治疗内毒素血症所致的心肌损伤具有重要临床意义。

黄花倒水莲(Polygala fallax Hemsl，PFH)是远志科植物黄花倒水莲的干燥根，具有良好的抗炎、抗病毒、抗氧化、抗应激及改善心肌缺血等作用[4,5]。但PFH对心肌损伤的保护作用及其机制尚不明确。本研究以大鼠心肌细胞株为研究对象，体外探讨PFH对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的大鼠心肌细胞损伤的作用及其潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1.1细胞来源 大鼠心肌细胞H9c2和CP-R073由中国科学院上海细胞库提供。

1.1.2主要试剂 黄花倒水莲(PFH，200 g，赣州市医药公司)；脂多糖(LPS，纯度≥99%，Solarbio公司)；LipofectamineTM2000转染试剂(碧云天生物技术研究所)；miR-369抑制物(miR-369-inhibitor)及阴性对照(inhibitor NC)、miR-369模拟物(miR-369-mimics)及阴性对照(mimics NC)、AKT1小干扰RNA(siRNA-AKT1)及阴性对照(siRNA-NC)(广州锐博生物科技有限公司)；MTT试剂、DMSO(日本同仁生物科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Pierce Biotechnology公司)；TRIzol、RIPA裂解液(Invitrogen公司)；AKT1抗体(美国Millipore公司，货号：02066000)；Bcl-2抗体、Bax抗体、辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠IgG抗体(Sigma-Aldrich公司，货号：ABC345、AB2915和AP183P)。

1.2方法

1.2.1细胞培养、转染 将H9c2和CP-R073细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。当细胞铺满培养皿时，加入1 ml胰酶消化细胞1 min，加入DMEM完全培养基终止消化。转移细胞悬液于离心管中，离心收集细胞进行传代培养。

收集对数生长期的心肌细胞，将细胞稀释后以2×105个/孔接种于6孔板，待细胞达60%左右融合时，参照LipofectamineTM2000转染试剂说明书分别将inhibitor NC、miR-369-inhibitor、mimics NC、miR-369-mimics、siRNA-NC、siRNA-AKT1转染至细胞，并分别记为anti-miR-NC组、anti-miR-369组、miR-NC组、miR-369组、si-NC组和si-AKT1组，每组设置5个复孔，重复实验3次。

1.2.2MTT实验 以10 μg/ml的LPS预处理H9c2细胞、CP-R073细胞，转染各组细胞12 h后，以1×104个/孔接种于96孔板，加入相应浓度的PFH(1、3、5 g/kg)，将未做任何处理的心肌细胞作为对照组(Con组)，仅用LPS处理的心肌细胞作为LPS组。分别于培养24、48和72 h时，加入MTT试剂20 μl培养4 h，加入DMSO 150 μl振荡反应10 min。酶标仪下测定各孔490 nm波长处吸光值，计算细胞抑制率。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 收集上述PFH处理48 h后的各组细胞，稀释至2×106个/ml转移至流式管，离心收集细胞，PBS溶液冲洗2次。参照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书，将细胞重悬于200 μl 1×Binding Buffer，并先后加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI避光反应。使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4qRT-PCR TRIzol法提取细胞总RNA，检测提取RNA样品的纯度和完整性，将RNA逆转录反应合成cDNA。分别选择U6和GAPDH为内参基因，以cDNA为模板，采用SYBR Green法进行qPCR反应。结果采用2-ΔΔCt法计算miR-369和AKT1 mRNA相对表达量。用引物序列：miR-369 F:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGG-CGAATAT-3′，R：5′-CTGGGAGATCGACCGTGTTAT-ATTCGC-3′；AKT1 F:5′-ATGAACGACGTAGCCATT-GTG-3′，R：5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′；U6 F:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，R：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；GAPDH F:5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′,R：5′-AGCCC-AGGATGCCCTTTAGT-3′。

漏电保护器的装设场所；由于人手握住手持式或移动式电器时，如果该电器漏电，则人手因触电痉挛而很难摆脱，触电时间一长，就会导致死亡，而固定式电器漏电，如人体触及，会因电击刺痛而弹离，一般不会继续触电.由此可见，手持式和移动式电器触电的危险性远大于固定式电器触电，因此一般规定，安装手持式和移动式电器的回路上应装设 RCD.由于插座主要是用来连接手持式和移动式电器的，因此插座式回路上也应装设RCD.GB50096-1999 《住宅设计规范》规定，除空调机电源插座外，其它电源插座回路均应装设RCD.

1.2.5Western blot 裂解法提取细胞总蛋白，BCA法测定样本蛋白浓度，将蛋白样品放入提前预热的100℃水浴锅中变性5 min，取35 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后取出凝胶，湿转法转移至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉封闭1 h后加入稀释后的蛋白一抗，4℃孵育过夜，洗膜4次，加入相应二抗室温孵育1 h。洗膜4次，加入ECL染色液显色，凝胶成像系统下曝光，应用Image软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.6双荧光素酶报告基因实验 为证实miR-369靶向AKT1基因，本研究将AKT1的3′UTR区和突变的3′UTR区构建双荧光素酶报告基因载体，并分别与miRNA-mimics阴性对照和miR-369-mimics转染心肌细胞，转染36 h后测定细胞中荧光素酶活性。

2 结果

2.1PFH对LPS诱导的心肌细胞H9c2、CP-R073增殖和凋亡的影响 与Con组相比，LPS组和LPS+PFH各剂量组H9c2和CP-R073细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05)(表1)；LPS+PFH(3 g/kg)组H9c2和CP-R073细胞增殖抑制率明显低于LPS组和LPS+PFH(1 g/kg)、PFH(5 g/kg)组(P<0.05)。本实验选择对PFH敏感性相对较好的H9c2细胞进行后续研究。

与Con组相比，LPS组和LPS+PFH各剂量组H9c2细胞中Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)，Bax蛋白表达升高(P<0.05)，细胞凋亡率升高(P<0.05)；与LPS组、LPS+PFH(1 g/kg)、(5 g/kg)组相比，LPS+PFH(3 g/kg)组细胞中Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)，Bax蛋白表达降低(P<0.05)，细胞凋亡率降低(P<0.05)(表2、图1)。

图1 PFH对LPS诱导的心肌细胞H9c2凋亡的影响Fig.1 Effect of PFH on LPS-induced apoptosis of H9c2 in cardiomyocytesNote:1.Con；2.LPS;3.LPS+PFH(1 g/kg);4.LPS+PFH(3 g/kg)；5.LPS+PFH(5 g/kg).

表1 PFH对LPS诱导的心肌细胞H9c2、CP-R073增殖的影响

2.2PFH对LPS诱导的心肌细胞中miR-369、AKT1表达的影响 与Con组相比，LPS组心肌细胞中miR-369相对表达水平升高(P<0.05)，AKT1 mRNA和蛋白相对表达水平降低(P<0.05)；与LPS组和LPS+PFH(1 g/kg)、(5 g/kg)组相比，LPS+PFH

表2 PFH对LPS诱导的心肌细胞H9c2凋亡的影响

表3 PFH对LPS诱导的心肌细胞H9c2中 miR-369、AKT1表达的影响

图2 AKT1蛋白的表达Fig.2 Expression of AKT1 proteinNote:1.Con;2.LPS;3.LPS+PFH(1 g/kg);4.LPS+PFH(3 g/kg);5.LPS+PFH(5 g/kg).

(3 g/kg)组细胞中miR-369表达水平降低(P<0.05)，AKT1 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。选择对心肌细胞损伤保护较为有效的PFH浓度(3 g/kg)用于后续实验。见表3、图2。

2.3抑制miR-369表达对LPS诱导的心肌细胞H9c2增殖、凋亡的影响 与LPS+anti-miR-NC组相比，LPS+anti-miR-369组心肌细胞中miR-369相对表达水平、心肌细胞增殖抑制率、Bax蛋白、心肌细胞凋亡率均降低，细胞中Bcl-2蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4、图3。

2.4过表达miR-369能逆转PFH对LPS诱导的心肌细胞H9c2增殖和凋亡的影响 与LPS+PFH+miR-NC组比较，LPS+PFH+miR-369组心肌细胞中miR-369相对表达水平升高，细胞抑制率增加，细胞中Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5、图4。

2.5miR-369靶向调控AKT1表达 生物信息学软件分析发现(图5A)，miR-369能够与AKT1的3′UTR区特异性结合。双荧光素酶报告基因实验结果(表6)，过表达miR-369抑制心肌细胞中AKT1转录活性，而将AKT1的3′UTR区突变后抑制作用消失。Western blot结果表明(表7、图5B)，过表达miR-369的心肌细胞中AKT1 mRNA和蛋白表达均降低，抑制表达miR-369的心肌细胞中AKT1 mRNA和蛋白表达均升高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

2.6抑制AKT1表达可逆转PFH对LPS诱导的心肌细胞增殖和凋亡 与LPS+PFH+si-NC组相比，LPS+PFH+si-AKT1组心肌细胞中AKT1蛋白表达降低(P<0.05)，细胞增殖抑制率升高(P<0.05)，细胞中Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)，Bax蛋白表达升高(P<0.05)，细胞凋亡率升高(P<0.05)。见表8、图6。

图3 抑制miR-369表达对LPS诱导的心肌细胞H9c2凋亡的影响Fig.3 Effect of inhibition of miR-369 expression on apoptosis of H9c2 induced by LPS

表4 抑制miR-369表达对LPS诱导的心肌细胞H9c2增殖、凋亡的影响

表5 过表达miR-369逆转PFH对LPS诱导的心肌细胞增殖、凋亡的影响

图4 凋亡蛋白的表达Fig.4 Expression of apoptotic proteinsNote:1.LPS;2.LPS+PFH;3.LPS+PFH+miR-NC;4.LPS+PFH+miR-369.

图5 miR-369靶向调控AKT1的表达Fig.5 miR-369 targets regulation of AKT1 expressionNote:A.3′UTR of AKT1 contains complementary nucleotide sequence of miR-369;B.miR-369 regulates expression of AKT1.1.miR-NC;2.miR-369;3.anti-miR-NC;4.anti-miR-369.

表6 双荧光素酶报告实验

表7 miR-369对AKT1表达的影响

表8 抑制AKT1的表达逆转PTS对心肌细胞增殖、凋亡的作用

图6 AKT1、凋亡蛋白的表达Fig.6 Expression of AKT1 and apoptotic proteinsNote:1.LPS;2.LPS+PFH;3.LPS+PFH+si-NC；4.LPS+PFH+si-AKT1.

3 讨论

LPS又称内毒素，是革兰阴性菌的重要致病成分，可诱发内毒素血症，因此本研究利用LPS诱导大鼠心肌细胞模拟内毒素血症时心肌细胞损伤，研究心肌损伤机制[6,7]。LPS诱导的心肌细胞增殖抑制和凋亡增加是心肌功能障碍的主要原因之一[8,9]。本研究表明LPS可诱导大鼠心肌细胞增殖抑制，细胞中Bcl-2下调和Bax上调，细胞凋亡率增加，而用3 g/kg的PFH处理后心肌细胞增殖抑制率明显降低，细胞中Bcl-2上调和Bax下调，细胞凋亡率降低，说明PFH能够保护LPS诱导的大鼠心肌细胞损伤。

miRNA是生物体内一类内源性非编码小RNA，已被证实在心肌梗死、心肌纤维化、心肌肥大等心血管疾病中起关键调节作用，是心血管疾病预防及治疗的潜在靶标[10-12]。丁桃等[13]利用miRNA芯片技术证实LPS诱导心肌组织中miR-194-3p、miR-465-3p、miR-547-3p等多种miRNAs差异表达，提示miRNA与LPS诱导的心肌损伤有关。本研究发现LPS可诱导大鼠心肌细胞中miR-369表达上调，而抑制miR-369表达后明显降低了LPS诱导的心肌细胞增殖抑制和凋亡增加，说明miR-369表达上调与LPS诱导的心肌细胞损伤有关。进一步分析发现PFH能够降低LPS诱导的心肌细胞中miR-369的表达，而过表达miR-369逆转了PFH对LPS诱导的心肌细胞损伤的保护作用，提示PFH可能通过抑制miR-369表达发挥对心肌细胞的保护作用。

PI3K/AKT信号通路是调节细胞增殖和凋亡的重要通路之一[14]。Chen等[15]研究报道，红景天甙可通过抑制体内外活性氧(ROS)介导的PI3K/AKT/mTOR信号途径，抑制LPS诱导的大鼠心肌细胞损伤。庄红等[16]研究报道，过表达miR-182可通过激活PI3K/AKT信号通路促进H2O2刺激的大鼠心肌细胞增殖并降低细胞凋亡率。提示PI3K/AKT信号通路与心肌细胞损伤有关。本研究通过生物信息学软件分析发现miR-369能够与AKT1的3′UTR区特异性结合，双荧光素酶报告基因实验证实大鼠心肌细胞中miR-369靶向负调控AKT1的转录活性。进一步分析发现，抑制AKT1表达能逆转PFH对LPS诱导的大鼠心肌细胞损伤的保护作用。推测PFH可能通过下调miR-369，进而靶向激活AKT信号通路，发挥对心肌细胞损伤的保护作用。

综上所述，PFH能抑制LPS诱导的大鼠心肌细胞中miR-369表达，引发细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2上调和凋亡蛋白Bax下调，并靶向促进AKT1表达，发挥对心肌细胞损伤的保护作用。本研究结果表明miR-369/AKT1途径是PFH保护心肌细胞损伤的分子可能分子机制之一，为PFH在心肌损伤的预防和治疗中奠定了实验基础。