阿米洛利对α2C肾上腺素受体别构调节作用的研究#

张萧萧 刘若凡 刘丽艳 黄宁 陈军利

（四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学教研室，四川 成都 610041）

α2肾上腺素受体（α2-adrenergic receptor,α2-AR）是G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors，GPCRs）超家族成员，属于A类（视紫红质类）GPCR受体，有α2A、α2B、α2C三种亚型[1,2]，主要在内源性儿茶酚胺、肾上腺素和去甲肾上腺素发生内源性生物学效应方面具有重要作用。其中α2C-AR主要参与一些神经系统障碍性疾病（如抑郁症、精神分裂症以及认知障碍等）的发生发展的过程[3,4]。因此，α2C-AR可能是治疗上述疾病的潜在药物靶点。

与传统的正性药物相比，别构调节剂具有副作用小、选择性高以及不影响内源性受体的正常生理学信号传导模式等优点，具有良好的潜在药物开发前景[5,6]。研究显示，阿米洛利及其类似物（如Benzamil）是多种GPCR家族受体的别构调节剂[7,8]，但是否对α2C-AR具有别构调节效应，目前尚未见报道。

本文主要是利用计算机辅助药物设计手段和药理学实验来检测阿米洛利和Benzamil与α2C-AR的潜在结合位点及其别构调节作用，为研发新型α2C-AR别构调节剂打下结构基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

COS-7细胞（ATCC），DMEM高糖培养基（HyClone），FBS（Gibco）,青霉素-链霉素溶液（Biosharp），PBS（HyClone），3H-RX821002（PerkinElmer），PEI40000（Polysciences），BCA试剂盒（碧云天），15 cm培养皿（NEST）。

1.2 方法

1.2.1 α2C-AR晶体结构补全

应用Accelrys Discovery Studio Client version 3.1 (Accelrys Software Inc.USA)，打开所需补全的α2C-AR的晶体结构（PDB ID:6KUW），在Protein Report中显示所缺失的氨基酸序列，在Hierarchy View中选中所缺失的序列，并填入缺失氨基酸的序列。

1.2.2 分子对接

在Discovery Studio 3.1软件中，对α2C-AR进行加氢，从“from receptor cavity” 定义结合口袋。应用CDOCKER对配体和受体进行分子对接，Tophit设置为10，Pose Cluster Radius为0.5，其他参数为默认值。

1.2.3 质粒瞬时转染

转染前1 d进行细胞铺板，以保证转染前细胞密度为60%-70%。转染前1 h，将细胞培养液换为不含血清、双抗的DMEM培养基。将质粒DNA和PEI40000按1:3比例分别加入不含血清、双抗的DMEM培养基中，混匀室温放置5 min，再将质粒和PEI混合并混匀，室温孵育15 min。向培养皿中加入混合后的转染试剂，37℃孵育4 h，弃去培养液，加入含血清、双抗的DMEM培养基继续培养48-72 h后提取膜蛋白。

1.2.4 膜蛋白提取

将转染后的细胞用10 ml的4℃PBS清洗两次，加入10 ml PBS刮下细胞，4℃，800g离心5 min，弃上清。加入20 ml HEPES buffer，用匀浆机进行匀浆，24000 rpm离心10 s，反复进行3次，每次间隔10 s，4℃1300 g离心10 min。吸取上清液至超高速离心管中，4℃100000 g离心1 h，弃上清。加入含10%甘油的HEM溶液，并用1 ml胰岛素注射器反复吹打15-20次，充分混匀后，每管50 μl分装，置于-80℃保存待用。应用BCA法对蛋白浓度进行测定。

1.2.5 受体表达实验

将不同浓度的膜蛋白与3.5 nM的3HRX821002共孵育1 h，加入4℃PBS终止反应，GF／B滤膜过滤，通过液体闪烁仪对样品放射性进行测定。加入100 μM酚妥拉明来检测非特异性结合。

1.2.6 解离动力学实验

在不同时间点，将含有α2C-AR的膜蛋白加入到含有3.5 nM3H-RX821002的HEM 缓冲液中，室温孵育1 h，在不同时间点加入100 μM酚妥拉明10 μL和Amiloride/Benzamil 10 μL（实验组），或100 μM 酚妥拉明10 μL（对照组）。加入4℃PBS终止反应，GF／B滤膜过滤，通过液体闪烁仪对样品放射性进行测定。

2 结果

2.1 α2C-AR晶体结构及其质量检测

在Discovery Studio3.1软件中打开α2C-AR的晶体结构（PDB ID:6KUW），可查见该蛋白Leu190到Ala197位氨基酸缺失，见图1A，插入缺失的氨基酸之后的结构如1B所示。酚妥拉明是α2-AR的阻滞剂，去甲肾上腺素是α2-AR的激动剂，我们采用CDOCKER将这两种化合物分别与α2C-AR进行分子对接，然后从对接模式最集中的簇中，选评分最高的对接模式进行分析。结果显示，这两种化合物均位于α2C-AR的胞内端，且均与Val236和Thr241形成氢键，提示Val236和Thr241可能是该两种化合物与α2C-AR的结合位点，见图1C和图1D。

2.2 阿米洛利及Benzamil与α2C-AR作用位点预测

为预测阿米洛利和Benzamil与α2C-AR的作用位点，我们采用CDOCKER将阿米洛利和Benzamil与α2C-AR进行分子对接。分子对接后产生10个对接模式，从对接模式最集中的簇中，选评分最高的对接模式分析。结果显示，与酚妥拉明和去甲肾上腺素相似，阿米洛利和Benzamil均位于α2C-AR的胞内端，其中阿米洛利与Glu377和Phe380形成氢键，见图2A，Benzamil与Asn160和Thr241形成氢键，见图2B。

图1 α2C-AR晶体结构及酚妥拉明和去甲肾上腺素分子对接

图2 阿米洛利、Benzamil与α2C-AR 分子对接

2.3 α2C-AR表达量检测

通过测定α2C-AR表达量发现，α2C-AR表达呈剂量依赖性，见图3，后续将选取5-10 μg的含有α2C-AR的膜蛋白进行解离实验。

图3 α2C-AR 表达

2.4 阿米洛利与Benzamil对3H-RX821002解离速度的影响

阿米洛利与对照组的HalfLife值分别为0.8710和0.9314，见图4A；Benzamil与对照组的HalfLife值为1.003和1.206，见图4B，阿米洛利与Benzamil对3H-RX821002的解离速度均无影响。

图4 阿米洛利（A）和Benzamil（B）对3H-RX821002解离速度的影响

3 讨论

α2C-AR是GPCR超家族一员，参与了多种神经系统疾病的发生发展过程，提示α2C-AR可能是这些疾病的潜在药物靶点。与作用于正性结合位点的化合物相比，别构调节剂具有副作用小、选择性高，且不影响受体信号传导模式等一系列优点。目前，多种GPCRs别构调节剂已被发现，并在疾病的治疗上取得了一定的疗效。例如，毒蕈碱型受体M1 和/或 M4的正性别构调节剂、多巴胺受体D2的负性别构调节剂（SB269652）治疗精神性疾病等[9]。

研究报道，阿米洛利及其类似物（如Benzamil）对多种GPCR家族受体具有别构调节作用[7,8]，因此，我们对其是否对α2C-AR具有别构调节效应进行了检测。首先，我们通过分子对接手段预测了此两种化合物与α2C-AR的结合位点。 发现，阿米洛利与α2C-AR的潜在结合位点包括Glu377和Phe380，Benzamil与α2C-AR的潜在结合位点包括Asn160和Thr241。

与设想不一样的是，这些位点与酚妥拉明和去甲肾上腺素的结合位点相近，提示，阿米洛利和Benzamil可能作用在α2C-AR的正性位点，而没有作用在其别构调节位点。然而，作为分子对接的众多软件之一，CDOCKER有其自身的局限性，比如不能进行柔性对接。因此，后续还需要采用其他的分子对接方法，比如flexible docking，或者分子动力学模拟，来进一步探讨阿米洛利和Benzamil与α2C-AR的作用模式。

配体受体解离动力学实验是检测化合物是否是别构调节剂的一种有效方法。我们的解离动力学实验结果显示，阿米洛利和Benzamil对3H-RX821002从α2C-AR上的解离速度没有影响，表明阿米洛利和Benzamil对3H-RX821002不存在别构调节作用。但是，别构调节剂具有配体依赖性，因此，将来，我们还需检测阿米洛利和Benzamil对其他配体的别构调节作用。